小核酸藥物相較于傳統的小分子化合物和抗體藥物，具有更高的靶向性和特異性，這使得它們能夠更有效地調控特定基因的表達，為治療各種疾病提供了新的途徑，在癌癥、遺傳性疾病以及病毒感染等方面展現出了巨大的潛力。然而，小核酸藥物的研究也面臨著一些重要挑戰。當前，研究人員正致力于提高藥物的穩定性，并優化其靶向性，以期能夠更好地利用小核酸藥物的治療優勢。

美迪西云講堂邀請在化學領域經驗豐富的田寶泉博士，為大家解答小核酸藥物研發過程中的常見問題。并帶您把握前沿動態,共同探討小核酸藥物的無限可能。

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01 您好，請問您認為小核酸藥物研發目前的難點在哪里？

田寶泉博士：在小核酸藥物研發過程中，涉及多個關鍵步驟。首先是序列的篩選和優化，設計小核酸藥物并不簡單，需要考慮其與非靶向基因的非特異性結合及可能出現的脫靶效應。由于許多mRNA具有不同的轉錄本，必須仔細研究其不同之處，以避免剪接時靶基因序列的漏失。因此，序列篩選通常需要進行大規模篩選，以確保在靶基因的不同位點都有合適的候選化合物，這是一個技術難點。

其次是化學修飾，目前的化學修飾已能基本解決小核酸穩定性的問題。然而，隨著臨床數據的積累，必須不斷發展化學修飾技術，以保持競爭力并避免被新一代藥物取代。另一個關鍵點是遞送系統，遞送系統的開發面臨著巨大的技術挑戰，尤其是針對肝外靶向遞送系統的開發。目前適應癥較為狹窄，為了促進小核酸藥物的快速發展，必須擴大其適應癥范圍。

最后，小核酸藥物的藥效、藥代和毒理評估也是關鍵步驟。由于其特殊的性質以及國內并無上市的小核酸藥物，探索準確評估小核酸藥物的安全性和有效性的評價方法同樣具有挑戰性。此外，后續生產工藝的后期放大和成本控制也是小核酸藥物研發中不可忽視的難題。

在國內，小核酸藥物的研發正處于初步階段，建立高效安全的評估體系尤為重要。這些問題都需要科研人員一一關注和不斷的完善和解決。

02 糖環并四元環的核苷酸單體有在臨床應用嗎？是否只有臨床前研究？個人覺得這個類型的核苷單體成本太高，是否不太具備性價比？

田寶泉博士：目前已有文獻報道糖環并四元環的存在。在臨床應用方面，有關于5’糖環并四元環破5‘-（E）-VP的專利，確實有一些已經應用于臨床。然而，目前僅有這些例子，糖環并四元環在核糖本身的，在臨床上尚未應用。在小核酸藥物中，核糖成環狀結構的鎖核酸在ASO藥物中確實有應用，例如采用gapmer結構的ASO藥物中使用到了鎖核酸的單體。、

關于價格高的問題確實存在，但是隨著產業化的進程，成本的問題是能夠解決的，例如我們在研發過程中，起初幾千元一克的單體化合物已降至現在的約300元一克，工藝研發部門正在努力進一步降低成本。新型的核苷酸單體一旦開發成功，根據小核酸研發的平臺優勢作用，可在多個管線應用，成本相對分攤后將不再是主要問題。在新藥開發中，化學修飾的選擇至關重要，雖然核酸單體的開發成本需謹慎考慮，但技術和平臺的進步使得化學修飾成為可行的選項。

03 單體的純度對寡核苷酸合成純度的影響？

田寶泉博士：確實是有影響，在我們的前期篩選階段，通常對純度的要求并不十分嚴格，有時候即使是95%的純度也能夠接受，98%的也是可以。然而，當進入后期工藝放大階段時，即便是99%的純度，如果單體中單雜含量超過了0.5%，會對后續純化工藝造成顯著的成本增加。因此，在單體質量控制方面，尤其是在工藝研發階段，嚴格控制質量是必不可少的。

04 最近酶法合成寡核苷酸技術有所突破，對固相合成有影響？

田寶泉博士：是的，近期在寡核苷酸合成領域，酶法技術取得了顯著進展。Alnylam等公司一直在推動酶法的固相合成方法，我參考的專利顯示，不同于一次性合成，他們采用分段的方法，先將幾個單體用固相法合成，再利用酶法特異性連接起來。酶法合成技術是否繼續發展尚不得而知，但它已經可以與傳統固相合成技術相比擬。在小規模合成中，酶法與固相合成技術表現相當，但要實現大規模生產，目前仍主要依賴固相合成。

當然，未來酶法技術的發展潛力巨大。兩三年前，也有人問起酶法合成小核酸藥物的可行性，那個時候確實只有固相合成這一個途徑，而現在情況可能已有所不同。

05 初篩序列的時候是否需要進行修飾？

田寶泉博士：初篩的時候不需要修飾，在研發過程中，初始篩選階段通常使用未修飾的裸序列。修飾通常在確認敲低率良好的序列后進行，因為若修飾方法不當，可能會導致敲除率嚴重下降。因此，我們不會在未經篩選的序列上直接進行修飾，以免增加其篩選失敗的風險。

如果擔心序列的穩定性問題，可以選擇例如在3’端添加dTdT以增加其穩定性。通常情況下凍干粉形式的裸序列可以保持數月，而溶液狀態下保持數周，其生物藥效也不會產生大的改變。因此，在初期篩選階段通常無需進行修飾，可以直接用裸序列進行篩選工作。

06 序列一開始就進行修飾設計的，和裸序列設計篩選后在修飾，哪一種更推薦？

田寶泉博士：建議首先進行裸序列的篩選。即使裸序列篩選工作良好，如果后續的修飾方法不當，體外往往無法表現出預期的效果，這種情況在實踐中非常多見。因此，推薦先對裸序列進行篩選，然后再考慮進行修飾。首先確定一個優秀的裸序列，然后在此基礎上進行不同的修飾，以驗證哪種修飾方法能夠保持其活性。

07 固相合成PS轉PO高怎么辦？

田寶泉博士：按照我的理解，在固相合成的時候，對于磷硫酰化反應后，確實會有磷酰化的。ASO藥物通常全部使用硫代是比較安全的，而siRNA藥物則僅在鏈端使用硫代基團。在鏈端個別磷酸硫代完后還要多次做磷酰化，因為無論是硫代還是磷酰化反應，都從亞磷酰胺轉化而來，而亞磷酰胺非常活躍。在磷酰化過程中，很容易發生硫代被氧化，這可能導致硫代磷酰化的單體重新被氧化成磷酸。因為磷酸是通過碘氧化來引入的，這個過程中，需要精確控制氧化劑在固相柱上的停留時間，以確保反應迅速進行。如果控制不當，可能會導致硫代磷酸再次轉化為磷酸。

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