大鼠帕金森氏病動物模型的建立——美迪西生物醫藥
帕金森氏病(Parkinsonts disease，PD)是常見的中樞神經系統變性疾病，其主要病理變化是中腦黑質細胞變性壞死，導致黑質紋狀體系統內多巴胺(DA)含量減少而發病。6一羥多巴胺(6一OHDA)是一種神經毒劑，可選擇性破壞含DA 的神經細胞。目前建立帕金森氏病動物模型最常用的方法是通過單靶點黑質毀損方法，此法由于定位不準及操作技術不穩等因素，成功率較低。 我們通過紋狀體兩點注射6-OHDA制備大鼠PD 模型，井對此模型的行為學和形態學進行評價。
1、材料和方法
1.1 材料
Spraque—Dawley大鼠，雄性，3O只，體重180～ 230g；6-OHDA(sigma公司)；阿樸嗎啡(APO，sigma公司)；兔抗酪氨酸羥化酶(TH)血清(中國科學院上海生物化學研究所惠贈)；ABC試劑盒(Vector公司)；大鼠腦立體定向儀為江灣一1型(上海江灣醫療器械廠)。
1.2 方法
將30只大鼠隨機分為實驗組(25只)及對照組(5只) 實驗組動物用1O％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉后，剪去頭部毛，將大鼠固定于三維腦立體定向儀上，切開頭皮和皮下組織、骨膜；將齒棒設定為一2。4 mm，確定前囟坐標，按包新民的大鼠立體定向圖譜確定右側紋狀體兩點坐標，第一點坐標是：前囟前1。0，矢狀縫右側3。0，硬膜下4。5；第二點坐標是：前囟后1。0，矢狀縫右側4。5，硬膜下6。0。 按上述坐標用微型磨鉆開顱后，用微量注射器將4 Fg／uL的6一OHDA(溶于0。2 抗壞血酸生理鹽水中)4 分0注入上述兩點，注射速度1~uL／min，注畢留針10 min，退針速度為1 mm／min，以防藥液溢出。術畢大鼠腹腔注射頭孢唑啉(50mg／kg)抗炎。對照組動物僅向兩點注射含0。2 抗壞血酸的生理鹽水4 L，余操作同前。
1周后開始檢測大鼠的誘發旋轉行為，每周一次，皮下注射阿樸嗎啡(0.05 mg／kg)誘發其旋轉行為。動物旋轉時以健側前肢或后肢為支點、身體環曲、首尾相接的原地旋轉，伴覓食樣動作。 旋轉360度為一轉(r)，60 min內記錄大鼠向損毀對側的旋轉瞬數。
從術后第1周開始進行大鼠腦組織形態學觀察，每周取1只能產生旋轉的大鼠的腦組織切片，作TH 免疫細胞化學染色，觀察大鼠右側中腦黑質多巴胺細胞的損毀情況。TH 免疫細胞化學染色方法：大鼠1O%水臺氯醛(500 mg／kg)深度麻醉后，經升主動脈快速灌注溫生理鹽水100 mL，而后用4℃ 的4％多聚甲醛(pH=7。4，0。1 mol／L PBS)800 mL灌注前固定，迅速斷頭取腦，將腦浸入4 多聚甲醛4℃ 過夜，再移入含30 蔗糖PBS中4℃過夜，直至腦組織沉入容器底部，然后作連續冰凍冠狀切片，片厚25 m。TH 免疫細胞化學染色過翟；切片用5 BSA 室溫孵育1 h TH(1：1500)4℃ 48 h；IgG(1：800)37℃ 2 h；ABC(1：100)37℃ 2 h；DAB顯色10 rain。 各步問PBS充分沖洗。 光鏡下觀察。
2、結果
紋狀體內注射6-OHDA 后l周，所有動物都設有誘發旋轉{至術后第2局才開始出現明
顯的旋轉，隨后緩慢上升；至術后5周才升至較高的水平并保持平穩第1、2、3、4、5周動物的旋轉次數分別平均為0。0、3。8、4。9、7。1和8。5 r／rain；其中有15只動物達到或超過了7 r／rain這一通常采用的標準，可作為PD模型鼠使用。成功率為6O 。 5只對照組大鼠均沒有產生旋轉行為。酪氮酸羥化酶免疫組化顯示：旋轉鼠術后第1周至第5周右側黑質TH免疫反應細胞逐漸減少，各個時期右側黑質TH免疫反應細胞較對傭明顯減少。不旋轉鼠右側黑質和左側黑質TH 樣免疫反應神經元未見明顯差異。
3、討論
帕金森氏病的臨床癥狀主要是由于黑質內多巴胺能神經元的漸進性的退行性改變所造成的，經典PD 模型是通過在大鼠的黑質或內傭前腦束內注射6-OHDA 麗復制的啪。6-OHDA是一種神經毒索，黑質內注射后，它可被大鼠中腦黑質內富含單胺氧化酶的多巴胺能神經元吸收，并在單胺氧化酶作用下轉化成自由基而對神經元造成損害。 從神經解剖學的角度來看，黑質的傳出纖維主要形成黑質紋狀體投射，即纖維自黑質發出后，沿黑質背內側上行經下丘腦外側、內囊內側部到達尾狀核頭部和殼核頭部，這一通路含多巴胺也是紋狀體內多巴胺的主要來源。 如果黑質內多巴胺能神經元被毀損，紋狀體內的多巴胺減少，當降至一定的水平時就會出現相應的類似PD的癥狀。而對于單例黑質毀損的模型，同側的黑質紋狀體通路被破壞，紋狀體內的神經元失去多巴胺能神經元的支配，其多巴胺受體便處于一種超敏狀態；當給予外源性的多巴胺受體激動劑如阿樸嗎啡后，動物損傷側的反應就強于健側而無法保持平衡，并向健側旋轉，旋轉的頻率大致與黑質內的多巴胺能神經元的受損程度一致。黑質內注射6一OHDA制備PD模型，有以下不足：(1)由于損傷部位緊鄰神經元胞體，因此神經元的毀損出現很早，在術后10 rain，應用免疫組化方法就可觀察到多巴胺能神經元的死亡，這一點使該模型與臨床PD病人的中腦黑質多巴胺能神經元的漸進性死亡不同(2)近距離的毀損很難把握程度，如果想模擬早期PD，則多巴胺能神經元的毀損不能超過8O ，用這種方法很難獲得這種部分毀損的模型且模型成功率很低，一般為40 ～50。 鑒于黑質內注射6一OHDA制備PD模型鼠存在的上述不足，我們通過紋狀體內注射6一OHDA制備PD模型鼠。由于紋狀體是黑質多巴胺能神經元的主要靶區，注射于其中的6。0HDA可被前者的末梢吸收，通過逆軸突轉運至黑質內的神經元胞體，在經單胺氧化酶轉化成自由基，可選擇性地破壞這些神經元而出現類似PD 的癥狀“]。 由于6-OHDA 必須通過逆軸突轉運才能到達中腦黑質，因此多巴胺能神經元的死亡是一種漸進的過程。 我們用32~g6一OHDA分兩點注射后，至術后第2周才開始出現明顯的旋轉，隨后緩慢上升}至術后5周才升至較高的水平并保持平穩。第1、2、3、4、5周黑質內TH 陽性神經元存活率逐漸減少；制備模型成功率達60 。因此無論從形態學還是行為學上來看，這種模型制備方法所造成的多巴胺能神經元損傷的確與臨床上PD病人的病程進展類似，是一種漸進的退變過程。 在對模型成功鼠持續1月的觀察中，動物的旋轉行為沒有自發恢復的現象，動物的健康狀況(如運動、飲食等)也無惡化的表現。
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