免疫組織化學染色(免疫組化)
一、原理
免疫組織化學技術是根據抗原與抗體特異性結合的原理，檢測組織中的肽和蛋白質的一種技術。現常用以下兩種檢測方法：
SP法：
一抗 + 生物素標記二抗 + 辣根酶標記鏈霉卵白素 + 辣根酶底物顯色
SABC法：
一抗 + 生物素標記二抗 + SABC（鏈霉卵白素 + 辣根酶標記生物素） + 辣根酶底物顯色
一般來說，SP法特異性較高，SABC法敏感性較高。
免疫組化最終顯色反應是通過酶與底物作用生成不溶性色素而完成的，所選用底物與呈色反應密切相關。最常用的是DAB,呈棕黃至棕褐色沉淀。
免疫組化
二、材料和試劑
1.試劑：酒精、二甲苯、枸櫞酸鹽、PBS、一抗、二抗試劑盒、DAB、樹膠等。
2. 儀器設備： 載玻片、染色缸、濕盒、移液器、微波爐、恒溫箱、冰箱、顯微鏡等。
三、染色程序
1.切片脫蠟至水；二甲苯Ⅰ（15分鐘）→二甲苯Ⅱ（15分鐘）→無水乙醇Ⅰ（5分鐘）無水乙醇Ⅱ（2分鐘）→90%乙醇（2分鐘）→80%乙醇（2分鐘）→70%乙醇（2分鐘）→蒸餾水（2分鐘）。
2. 3% H2O2，室溫10-20分鐘，滅活內源性酶。(30% H2O2 1份+雙蒸水9份混合配制新鮮)
PBS洗2分鐘×2次；
3.微波修復：將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液PH6.0）電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔2～3分鐘后，重復2～3分鐘，自來水浴冷至室溫，PBS洗2分鐘×2次；
4.滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘， 不洗，甩去多余液體。阻斷組織與抗體非特異性結合，降低背景染色；
5.滴加Ⅰ抗（濃縮液要適當比例稀釋，滴加量要根據組織大小，1cmⅩ1cm大小40ul左右），37℃1-2小時或4℃過夜；PBS洗5分鐘×3次；
6.滴加生物素化二抗, 37℃或室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×3次；
7.滴加試劑復合物，37℃或室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×3次；
8.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒,室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在5分鐘之內；
9.流水沖洗；
10.蘇木精復染2分鐘；
11.流水藍化15分鐘；
12.干燥箱烤干、二甲苯透明、中性樹膠封片，置入烤箱烤片。
四、注意事項
1.切片要盡量薄、平、無刀痕；
2.滴加試劑前要先甩去切片PBS，再用吸水紙把組織周圍的水擦干，防止抗體流失分散，但不能干片。
免疫組化相關試劑：
振動切片封閉液(PNBS): （10ml）
終濃度： 儲液：
10%NS(二抗種屬正常動物血清) NS 1ml
2%BSA 10%BSA 2ml
5%蔗糖 20%蔗糖 2.5ml
+PBS PH7.4 to 10ml
MEMFA：（10ml）
終濃度： 儲液：
0.1M MOPS 1M MOPS 1ml
0.1mM EGTA 10mM EGTA 2ml
1mM MgSO4 1M MgSO4 10μl
3.7%PFA 10%PFA 3.7ml
+d2H2O to 10ml
AP-CDS：(100ml)
終濃度： 儲液：
100mM Tris-Cl PH9.5 1MTris-Cl PH9.5 10ml
50mM MgCl 1M MgCl 5ml
100mM NaCl 5M NaCl 2ml
0.1% Tween-20 Tween-20 100ml
5mM levamisole 1M levamisole 500ml
+d2H2O to 100ml
HRP-CDS: (1ml)
(1)6.6ml H2O2 in 100ml 0.1M TB PH 7.5
(2)20ml DAB（0.05g/ml in d2H2O）+5ml(1)液+0.1M TB PH 7.5 to 1ml
10%多聚甲醛配制方法：(100ml)
稱取10克多聚甲醛(SIGMA P6148)粉末，置于250ml錐形瓶中，加入80ml 1xPBS，再加入5-6滴（1ml吸頭）10N NaOH, 于65°C水浴中溶解3-4小時，完全溶解后冷卻至室溫，調整PH值至7.4, 溶液定容至100ml，過濾后分裝成每管4ml 或8ml, 保存于-20°C。使用前將貯液置于80°C水浴中溶解，1xPBS稀釋至4%，即可使用。(配好后4°C密閉保存，24小時內使用。)
或直接配制4%PFA, 方法同上（可不加NaOH促溶，則不用調PH），配好后4°C密閉貯存，24小時內使用。
0.5%明膠處理載玻片方法：
800ml處理液：
1.溶解4g 明膠和4g硫酸鉻鉀于 800ml d2H2O中，65°C加熱30min左右，使其溶解（不要使溶液沸騰）
2.過濾溶液，并將溶液在室溫下放置至50°C左右。
3.將玻片在溶液中浸提3-4次。
4.將處理的玻片在室溫下過夜使其蒸發干，為防止灰塵，用保鮮膜覆蓋。
5.130°C烤干3小時以上。
6.干燥保存。
處理液使用后，可加入0.05%NaN3，4°C保存。下次使用時將溶液加熱至50°C即可。
蛋白膠配制方法：
取新鮮雞蛋清充分攪拌， 4°C過濾，清液加入等體積無熒光甘油，再加入0.05%NaN3充分混合，分裝成每管1ml，-20 °C保存。
熒光封片劑（Mowiol）配制方法：（約24ml）
將2.4g mowiol、6g甘油和6ml去離子水放入 50ml 離心管中，室溫2小時，直至mowiol完全長大變透明。加12ml0.2M Tris buffer （pH 8.5），50°C（過夜），直到mowiol完全溶解。4000-5000 rpm 離心20 minutes。分裝成每管1ml，-20°C保存。
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