攻克乙肝不是夢，基因編輯靶向“剪切”乙肝病毒

2015-07-21

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7月28日是一年“世界肝炎日”，肝炎是肝臟的炎癥，最常見的原因是病毒感染。病毒性肝炎分為甲、乙、丙、丁和戊型，雖然病毒種類不同，但都足以對人構(gòu)成嚴(yán)重危害，其中乙型和丙型肝炎可以導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生，給全球帶來嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，全球有20多億人曾受到過乙型肝炎病毒（HBV）感染，大約3.5億至4億人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。我國的乙肝病毒感染率約60%-70%；乙肝表面抗原攜帶率約占總?cè)丝诘?.18%，以此計(jì)算，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。

基因編輯技術(shù)助力剪切乙型肝炎病毒

根據(jù)6月2日發(fā)表在Scientific Reports上的研究結(jié)果，該研究小組靶向切割了乙肝病毒（HBV）共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的一些特異位點(diǎn)。在一項(xiàng)新研究中，麻省理工學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對受到感染的哺乳動物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。

HBV共價閉合環(huán)狀DNA是乙肝復(fù)發(fā)的“元兇”

乙肝患者面臨著形成肝硬化或甚至肝癌的高風(fēng)險。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會重新活化。這是因?yàn)閏ccDNA “匿藏”在細(xì)胞核中。

HBV的基因組（rcDNA）進(jìn)入到細(xì)胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細(xì)胞因子的幫助下修復(fù)成cccDNA。前基因組RNA（pgRNA）出核后，在胞質(zhì)中形成εpgRNA，并與病毒的聚合酶P蛋白共價結(jié)合，誘發(fā)核衣殼化。

與多數(shù)其他的病毒DNA的機(jī)制不同，HBV cccDNA通過pgRNA的反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行復(fù)制，而cccDNA主要以微小染色體的形式存在于肝細(xì)胞內(nèi)，且其半衰期很長（33～100天），細(xì)胞核內(nèi)的最長壽命可達(dá)14年。只要還存在于肝細(xì)胞中，cccDNA乙肝病毒的復(fù)制就不會停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝細(xì)胞，而這是導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)的根本原因。

因此，盡管每個肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清除肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

CRISPR/Cas技術(shù)——基因編輯的“神器”

CRISPR/Cas技術(shù)是源于細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點(diǎn)特異性的RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶位點(diǎn)序列進(jìn)行修飾。

其中的一個關(guān)鍵因子就是Cas酶，能用于切斷靶標(biāo)DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個就是稱為導(dǎo)向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。

隨著以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)靶標(biāo)特異性不斷得到提高，其在血液病、腫瘤、傳染病和其他遺傳疾病等一系列與人類健康和疾病相關(guān)的基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。

CRISPR/Cas9——靶向切斷慢性HBV感染

論文的主要作者之一Vyas Ramanan說：“我們?yōu)槲磥砝肅RISPR/Cas9來靶向切斷慢性HBV感染提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。”Ramanan和同事們設(shè)計(jì)了24條單鏈向?qū)NAs（sgRNAs）來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。

經(jīng)過初篩測試后，研究小組將三個最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)到了整合HBV的人類肝細(xì)胞內(nèi)。Ramanan說：“對包含整合基因組病毒DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系展開實(shí)驗(yàn)，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達(dá)和復(fù)制均顯著減少。“進(jìn)一步地在從頭感染模型中我們開展研究，在第9天我們看到這些病毒參數(shù)同樣大幅度降低。”

現(xiàn)在，Ramanan計(jì)劃在人類肝嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達(dá)人類功能性的治愈。他表示，盡管還有很多的工作要做，但其認(rèn)為這是一個有趣的開始。

攻克乙肝不是夢，基因編輯靶向“剪切”乙肝病毒

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