單細胞測序的重要性

隨著第二代測序(next generation sequencing，NGS) 技術和第三代測序( third generation sequencing，TGS)技術的飛速發展，引起生物研究領域的巨大變革。以前，需要從大量細胞中獲取足夠多的DNA 進行測序，因此測序結果是這些細胞“整體”的表征。然而，由于細胞異質性，相同表型的細胞的遺傳信息可能存在顯著性差異，很多低豐度的信息會在整體表征中丟失。為了彌補傳統高通量測序的局限性，單細胞測序技術應運而生。

單細胞測序技術是指在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術。它能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性，在腫瘤、發育生物學、微生物學、神經科學等領域發揮重要作用，正成為生命科學研究的焦點。2013年單細胞測序技術被Nature Methods評為年度技術（圖1左）。同年，《科學》雜志（Science）將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首，認為該技術將改變生物界和醫學界的許多領域。由于單細胞測序技術廣闊的應用前景，2015年單細胞測序技術再度登上Science 轉化醫學封面（圖1右）。圖1.單細胞測序技術榮登頂尖雜志年度封面 (圖片來源http://t.cn/R840r7W；http://t.cn/RQHjnW3)

2017年10月16日，與“人類基因組計劃”相媲美的“人類細胞圖譜計劃”（圖3） 首批擬資助的38個項目正式公布。人類細胞圖譜計劃是一項大型國際合作項目：根據獨特的分子信息（如基因表達）對所有人類細胞種類進行定義，并將這些信息與傳統的細胞學表述（如位置和形態）相關聯。其中一項關鍵的技術就是單細胞測序。

相信未來單細胞技術，將會大大改變人類的科學研究以及臨床應用，尤其是在腫瘤、微生物、神經科學、免疫學等領域。下面我們將重點介紹近年來單細胞技術在以上領域的重要發現。

單細胞測序的應用

1、 在腫瘤研究中的應用

    2012年3月2日，深圳華大基因研究院在腫瘤研究上獲得突破性進展，于國際著名學術期刊《細胞》（Cell）上同時發表兩篇研究論文。該工作研發了一種解析單細胞基因組的新方法，并將該方法應用于原發性血小板增多癥（一種血癌）和腎透明細胞癌（一種腎癌）（圖4）的腫瘤內部遺傳特征研究。此新方法解決了之前無法解決的腫瘤高異質性難題，為深入研究癌癥發生、發展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。

圖3.華大單細胞測序技術分別應用于血癌和腎癌研究

    2016年，麻省總醫院MGH、Broad研究所的研究人員在單細胞水平上對腦瘤進行基因組分析，首次在人類腦瘤樣本中鑒定到了癌癥干細胞及其分化后代 。研究人員分析了六個早期少突膠質細胞瘤樣本的四千多個腫瘤細胞，發現腫瘤細胞在發育上可以分為三類。其中一類比較像神經干細胞，另外兩類具有一定的分化特征。研究結果證實了癌癥干細胞是少突膠質細胞瘤的主要生長源，這些細胞將成為很有前景的治療靶標。

    圖4:在單細胞水平上對腦瘤進行基因組分析

2、在微生物研究中的應用

    單細胞測序在微生物領域也取得了重要突破。2017年，來自美國UCSF的研究組首次實現原核生物的微生物單細胞測序技術。圖5展示了該研究的詳細流程。

    圖5：基于微流控技術實現微生物單細胞測序

3、在神經科學中的應用

單細胞測序技術幫助科學家更深入的了解大腦神經細胞。2017年，Salk生物研究所領導的團隊根據甲基化和調控特征，區分小鼠和人類大腦樣本中的神經元亞型，并鑒定出人類額葉皮質中一組新的神經元。研究人員利用單細胞甲基化測序分析小鼠和人類額葉皮質樣本中近6200個神經元，并根據甲基化和調控元件特征對已知的神經元亞型進行聚類。此外，他們還指出人類大腦中存在一種新的神經元亞型，稱為“第6層興奮性神經元”，它們有著獨特的甲基化標記。

    這篇論文的通訊作者之一、Salk研究所的計算神經生物學研究人員Margarita Behrens表示：“我們的研究表明，我們能夠根據神經元的甲基化組來清晰定義神經元類型。這有助于我們了解同一區域、外表相似的兩種神經元為何表現不同。”

    圖6: 通過高通量單細胞甲基化測序得到小鼠和人額葉皮層神經元細胞的亞型

2018年初，張鹍教授團隊在Nature Biotechnology上發表了一個基于全新單細胞核測序方法的成年人腦第二代單細胞圖譜。該研究通過結合基于微流體的單核測序（snDrop-seq）和單細胞轉座體超敏性位點測序（scTHS-seq）的方法，不僅能利用轉錄組學分析鑒定不同功能的細胞類型，還能通過表觀遺傳學特征更好描述這些表達圖譜是如何調節或者維持的。該研究檢測了超過60，000個來自成人大腦皮層和小腦的單細胞，發現了35種不同的神經元和神經膠質細胞亞型。并且發現了這些細胞中哪些亞型更易受到不同腦部疾病常見危險因素的影響。

4、在免疫學領域的應用

由于傳統的免疫細胞分析方法，取樣來自一大堆細胞，低估了單個免疫細胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測單個免疫細胞的遺傳物質，從而理解機體復雜的免疫機制。

2017年，Ido Amit團隊在大腦中發現一種新型免疫細胞——disease-associated microglia（DAM），證實DAM細胞負責降解死亡的細胞以及與阿爾茲海默癥相關聯的蛋白病斑。研究人員強調，只有對單個細胞進行RNA測序才能發現罕見的小膠質細胞，從而為治療包括阿爾茲海默癥等在內的神經類疾病提供新方法。

    2017年，來自Broad研究所等機構的科學家們借助單細胞基因組學技術在人類免疫系統中鑒定出了新型細胞。他們通過對健康獻血者分離獲得的約2400個單細胞RNA進行了測序，并富集HLA-DR+細胞系，嘗試 對DC細胞和單核細胞的分類進行重新鑒定和修訂。這一成果是人類細胞圖譜（Human Cell Atlas）計劃的首批重要發現之一。該計劃旨在描述人體內的每一個細胞，以期加速生物醫學的發展，將徹底改變醫生和研究人員如何理解、診斷和治療疾病。

    圖9.人類血液中樹突細胞和單核細胞圖譜

結語

單細胞測序技術從誕生至今，僅僅短短數年的時間，便取得了飛速的發展以及矚目的成果。2009年、2010年，在頂級期刊發表的單細胞測序技術類文章數均僅有3篇。而到2013年、2014年該數目分別為23及27篇。現在單細胞測序技術越來越受到科研工作者及臨床工作者的青睞，每年有越來越多的重要成果發表在頂級期刊上。

而華大基因，在單細胞測序領域也取得了重大突破。2012-2017年，在單細胞測序領域華大基因一共發表了15篇文章，影響因子最高44，累計影響因子高達189。下面圖表是華大基因在單細胞測序領域的代表性文章：

    表1.華大單細胞測序高分文章列表