上海美迪西的生物部在體外生物學(xué)領(lǐng)域有豐富廣泛的經(jīng)驗(yàn)，通過酶水平測定、細(xì)胞水平測定、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、體外同位素測定、穩(wěn)定細(xì)胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術(shù)等，提供一套完整的生物學(xué)服務(wù)。

Western印跡分析

表達(dá)水平的Akt和磷酸化Akt在腫瘤的老鼠

蛋白印跡原理

    蛋白印跡實(shí)例

蛋白印跡法(Western blotting)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

蛋白印跡(Western Blot)顯色的方法主要有以下幾種：
1. 放射自顯影
2. 底物化學(xué)發(fā)光ECL
3. 底物熒光ECF
4. 底物DAB呈色

免疫印跡基本步驟：
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分離蛋白質(zhì)，主要依據(jù)其分子量和電荷的差異，而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異，因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中加入含有SDS，其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，電泳樣品加入樣品緩沖液后，要在沸水中煮5分鐘變性使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化，蛋白質(zhì)也完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定的存在于均一的溶液中，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷，從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計(jì)，消除了不同分子之間原有的電荷差別，其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小，這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部。最常見的凝膠電泳緩沖液由Tris-glycine組成。緩沖液可以包含0.1%去污劑，通常是SDS。Tris-glycine可用于分離很寬分子量范圍（6 - 200 kDa）的蛋白質(zhì)，并且與變性或非變性條件相容。

免疫印跡法分三個(gè)階段進(jìn)行：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)——>電轉(zhuǎn)移——>酶免疫定位。免疫印跡檢測的具體操作過程存在很大差異。其中最常見的是直接和間接檢測，間接檢測法即一抗首先與抗原結(jié)合，再加入能與一抗特異結(jié)合標(biāo)記過的二級(jí)抗體。標(biāo)記物包括生物素、熒光探針（如熒光素和羅丹明）和酶（如HRP和AP）。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是單個(gè)二級(jí)抗體可測定多種多樣的一級(jí)抗體從而避免了逐一標(biāo)記一級(jí)抗體，另一方面一抗通常能與幾個(gè)二抗分子結(jié)合，從而起了信號(hào)放大的作用。其缺點(diǎn)是檢測過程增加了額外的溫育步驟。

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