疫苗被認(rèn)為是針對傳染病的最有效的全球衛(wèi)生干預(yù)措施之一，當(dāng)下和未來的疫苗研發(fā)都面臨著更加有效和多樣化的保護(hù)反應(yīng)以及越來越嚴(yán)格的安全系數(shù)的挑戰(zhàn)。開發(fā)新疫苗方法和制劑的主要挑戰(zhàn)是增加有效的免疫激活，導(dǎo)致保護(hù)性應(yīng)答，同時(shí)限制過度的炎癥。為了增強(qiáng)免疫反應(yīng)，研究人員已經(jīng)研究了Toll樣受體激動(dòng)劑作為疫苗佐劑，因?yàn)樗鼈兛梢约せ钕忍烀庖呦到y(tǒng)，促進(jìn)多種免疫基因的表達(dá)，包括對T細(xì)胞重要的炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體。有效的TLR激動(dòng)劑可刺激所需的細(xì)胞或體液適應(yīng)性反應(yīng)，并已成功開發(fā)出幾種疫苗，然而無法直接調(diào)節(jié)炎癥增加了疫苗成本并延緩了其應(yīng)用?，F(xiàn)在有多種成功的TLR激動(dòng)劑可用于疫苗，但是新的和高劑量的TLR激動(dòng)劑面臨的挑戰(zhàn)之一是過度活化或全身分布引起的過度炎癥。

改善佐劑反應(yīng)是開發(fā)針對某些病原體疫苗的最有希望的途徑，佐劑開發(fā)中的一項(xiàng)最大的挑戰(zhàn)就是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，同時(shí)保持免疫激活和保護(hù)作用。目前尚無批準(zhǔn)具有獨(dú)立調(diào)節(jié)炎癥和保護(hù)作用能力的佐劑。在這里，研究人員展示了一種增強(qiáng)保護(hù)反應(yīng)同時(shí)限制炎癥的方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員將部分選擇性核因子κB（NF-kB）抑制劑與幾種目前的佐劑聯(lián)合使用，所得疫苗可減輕全身性炎癥并增強(qiáng)保護(hù)性反應(yīng)。研究人員證明了這種方法可以增強(qiáng)保護(hù)，并且該方法已在多種佐劑和抗原中進(jìn)行了測試，不僅可以減少炎癥，還可以增強(qiáng)對流感、HIV等病毒的保護(hù)性反應(yīng)，最終也可以用于開發(fā)新冠疫苗，該項(xiàng)研究成果近日發(fā)表在《Science Advances》上。

檢查CpG誘導(dǎo)的炎癥和產(chǎn)生的免疫反應(yīng)

研究人員試圖驗(yàn)證SN50可以使抗原呈遞細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞表面受體，同時(shí)限制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。將小鼠骨髓的來源樹突狀細(xì)胞與SN50和CpG或CpG單獨(dú)孵育了6小時(shí)，并分析了增效劑如何改變細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞表面受體的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色顯示，用SN50處理的細(xì)胞表現(xiàn)出表達(dá)TNF-α和IL-6的細(xì)胞明顯減少。同時(shí)，CD86表達(dá)顯著增加并且CD40表達(dá)持續(xù)。因?yàn)閜65-p50二聚體是在靜息細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的最豐富的二聚體，并且參與炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，所以推測通過抑制該二聚體可以在限制炎癥細(xì)胞因子的同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面受體的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

在觀察到SN50可以限制炎癥而不降低體外細(xì)胞表面受體的表達(dá)后，研究人員接下來想在體內(nèi)研究這種作用。為了確定對NF-κB的抑制是否可以降低與CpG疫苗接種相關(guān)的促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的全身水平。在人體中，全身性TNF-α與局部副作用（例如注射部位腫脹和疼痛）相關(guān)，全身性IL-6與疫苗接種后的全身系統(tǒng)副作用（例如疲勞和頭痛）相關(guān)。此外，這兩種細(xì)胞因子在全身分布時(shí)均充當(dāng)熱原，會(huì)導(dǎo)致發(fā)燒反應(yīng)。研究人員在所有組中注射后1、3、6、24和48小時(shí)測量了這些促炎細(xì)胞因子，以確定響應(yīng)CpG疫苗接種時(shí)細(xì)胞因子達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)。為了確定SN50如何影響體液反應(yīng)研究人員在第28天分析了血清抗體水平，為了廣泛確定SN50的添加如何影響抗體水平使用酶聯(lián)免疫吸附測定來測量總Ig（G + A + M）。與單獨(dú)的PBS相比，CpG組的抗OVA抗體增加了2.4倍。接種了CpG + SN50的小鼠比PBS組增加了5.9倍，而CpG組增加了2.7倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了添加SN50會(huì)增強(qiáng)下游的適應(yīng)性反應(yīng)，從而導(dǎo)致免疫增強(qiáng)。由于疫苗接種后適應(yīng)性反應(yīng)的增加和耐受性的改善，研究人員將SN50歸類為免疫增強(qiáng)劑。

體內(nèi)流感激發(fā)模型的免疫增強(qiáng)

接下來研究人員將重點(diǎn)關(guān)注SN50如何過渡到具有病毒挑戰(zhàn)的疫苗。研究人員選擇流感疫苗作為概念驗(yàn)證疫苗，是因?yàn)樗哂型ㄓ眯?，并且相對容易操作。研究人員試圖確定SN50是否會(huì)減少與強(qiáng)佐劑相關(guān)的副作用，并觀察這種改變對全身細(xì)胞因子的保護(hù)作用。研究人員在2017/2018流感季節(jié)使用Fluzone四價(jià)疫苗注射給小鼠，有無CpG（50μg）作為免疫佐劑，有500μgSN50（SN50H或50μgSN50（SN50 L）作為免疫佐劑免疫增強(qiáng)劑。Fz + SN50組的TNF-α水平低于單獨(dú)Fz。在所有組中，添加SN50可使TNF-α和IL-6的水平降低至與安慰劑組一致的水平。為了檢查SN50是否可以減輕接種疫苗的副作用，研究人員分析了接種后24、48和72小時(shí)的體重變化百分比。體重減輕是小鼠副作用最客觀的度量，到24小時(shí)時(shí)，接種Fz和Fz + SN50的小鼠平均損失0.85和0.75％，F(xiàn)z + CpG組平均損失5.9％。在第72小時(shí)，F(xiàn)z組的體重為起始體重的-1.1％，而接種Fz + SN50的小鼠體重增加了+ 1.5％。Fz + CpG組的體重減輕了起始重量的-1.6％，添加SN50 H導(dǎo)致體重減輕（變化0％），添加SN50 L導(dǎo)致體重減輕了-1.3％。總體而言，具有SN50的小鼠比沒有SN50的小鼠體重減輕得更少，這表明SN50降低了與疫苗接種相關(guān)的副作用，并提高了疫苗的耐受性。

在第28天，研究人員分析了血清中血液中的抗體水平，F(xiàn)z和Fz+ SN50之間的血清IgG濃度無顯著差異，F(xiàn)z樣品和Fz+CpG之間有2.9倍的顯著差異。接種CpG的組之間無顯著差異，這表明添加SN50可以減輕炎癥和疫苗接種的副作用，提高耐受性，同時(shí)保持抗體濃度。接下來，研究人員試圖確定在疫苗中加入SN50是否會(huì)增強(qiáng)對Fluzone的保護(hù)。在此階段沒有對小鼠施用任何額外的SN50，因此只有疫苗誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和隨后的加強(qiáng)免疫可以起到保護(hù)小鼠免受流感的作用。在Fz+CpG中添加SN50可提供同等的保護(hù)，同時(shí)可改善初次接種疫苗的副作用和耐受性，在Fz中添加SN50可提供等同于Fz+CpG組的增強(qiáng)保護(hù)。這表明SN50除了提高耐受性外，還可以增強(qiáng)疫苗的適應(yīng)性免疫潛能。

新疫苗佐劑的耐受性和保護(hù)性通常被認(rèn)為是兩個(gè)具有反比關(guān)系的相互依賴的變量，其中通過限制耐受性獲得了足夠的保護(hù)，反之亦然。由于這種增強(qiáng)劑使疫苗既安全又更具保護(hù)性，研究人員想要尋求一種單一方法來分析SN50如何改變耐受性和保護(hù)性。由于這些變量被認(rèn)為是負(fù)相關(guān)的，因此很少有相關(guān)的先例。遵循評分系統(tǒng)的先例，研究人員開發(fā)了一個(gè)容忍度與保護(hù)度的關(guān)系圖，該圖僅用作本研究中收集的所有數(shù)據(jù)的直觀表示。在疫苗接種中包括SN50的所有組均增加了耐受性和疫苗保護(hù)性。綜合所有數(shù)據(jù)后得出結(jié)論，SN50通過增加耐受性和改善疫苗接種的保護(hù)效果而充當(dāng)免疫增強(qiáng)劑。

改善各種TLR和物種的佐劑反應(yīng)

為了檢查SN50在各種TLR激動(dòng)劑中的作用，研究人員對用SN50處理的RAW巨噬細(xì)胞進(jìn)行了定量聚合酶鏈反應(yīng)，然后用不同TLR的激動(dòng)劑進(jìn)行刺激。用SN50和脂多糖（LPS;10ng/ml）、CpG（5μg/ ml）、R848（1μg/ml）和Pam3CSK4（100ng/ml）刺激細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)錄水平與TLR激動(dòng)劑處理的細(xì)胞進(jìn)行比較單獨(dú)使用。在RAW巨噬細(xì)胞中，研究人員觀察到TNF-α和IL-6的下調(diào)促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。與單獨(dú)的激動(dòng)劑相比，在所有激動(dòng)劑中細(xì)胞表面受體CD86和MHCII轉(zhuǎn)錄水平均被上調(diào)。這與體內(nèi)觀察結(jié)果相吻合，當(dāng)在SN50與CpG一起使用時(shí)，淋巴結(jié)內(nèi)cd86表達(dá)增加并且細(xì)胞活性增加，這表明增加T細(xì)胞反應(yīng)和增加與T細(xì)胞中細(xì)胞遷移和細(xì)胞毒性相關(guān)的基因表達(dá)的相同作用對于大多數(shù)佐劑將維持不變。

為了檢查其在體內(nèi)的翻譯方式，研究人員使用gp120作為抗原為小鼠接種了CpG（50μg）、Pam3CSK4（20μg）和R848（50μg），將這些佐劑與最廣泛使用的明礬（250μg）一起使用。使用CpG觀察到完全消除了全身性TNF-α和IL-6促炎細(xì)胞因子，使用R848和Pam3CSK4發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6均顯著降低。僅明礬不會(huì)引起全身性細(xì)胞因子應(yīng)答，并且添加SN50不會(huì)改變細(xì)胞因子譜。這些數(shù)據(jù)表明，SN50在廣泛的佐劑上可用于減輕全身性炎癥，同時(shí)維持提高適應(yīng)性反應(yīng)，這證明了該系統(tǒng)對大量免疫佐劑具有廣泛的潛在用途。

為了了解這種效果如何轉(zhuǎn)化為人類疫苗，研究人員用含或不含SN50的LPS（1μg/ ml）處理了THP-1單核細(xì)胞。用SN50和LPS處理的細(xì)胞表達(dá)的TNF-α和IL-6水平明顯降低，還觀察到CD40和CD86的水平增加。用SN50和LPS或單獨(dú)的LPS刺激了NHP PBMC 6小時(shí)，并分析了細(xì)胞上清液中的促炎細(xì)胞因子，用LPS刺激的細(xì)胞在細(xì)胞上清液中顯示出高水平的TNF-α和IL-6，而具有SN50的細(xì)胞則顯示出細(xì)胞因子水平的顯著降低。因此與單獨(dú)用LPS刺激的細(xì)胞相比，用SN50和LPS刺激的細(xì)胞中CD86表達(dá)增加了兩倍，這意味著SN50在NHP和人類中的作用可能與在小鼠中的相似。

結(jié)果與討論

使用廣泛的TLR激動(dòng)劑，在體內(nèi)和體外均顯示NF-κBp50亞基的細(xì)胞可滲透抑制劑，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，減少炎癥和副作用，同時(shí)增加抗體反應(yīng)。CpG與免疫增強(qiáng)劑的共同給藥可導(dǎo)致全身促炎性細(xì)胞因子水平顯著降低，通常降至無法檢測的水平。同時(shí)，添加免疫增強(qiáng)劑導(dǎo)致模型抗原OVA抗體的IgG水平增加三倍，這表明有可能增強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)同時(shí)限制先天免疫系統(tǒng)引起的炎癥。SN50是數(shù)百種類似的NF-κB增效劑之一，當(dāng)與適當(dāng)?shù)腡LR激動(dòng)劑結(jié)合使用時(shí)，許多增強(qiáng)劑可用于引發(fā)針對不同疫苗或免疫療法的特異性和潛在可調(diào)性反應(yīng)，該方法有潛力使更廣泛的模式識(shí)別受體（PRR）激動(dòng)劑能夠安全地用于疫苗中，并擴(kuò)大可安全施用佐劑的窗口。它還可能增加適應(yīng)性免疫譜的多樣性，并擴(kuò)大疾病的預(yù)防和治療范圍。

總而言之，研究人員已經(jīng)證明將特定的NF-κB抑制劑與常見的免疫佐劑結(jié)合使用可以降低全身促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)提高細(xì)胞表面受體的表達(dá)，從而在小鼠、人類和NHP原代細(xì)胞中有效地呈遞抗原并激活T細(xì)胞。在體內(nèi)使用這種抑制劑可將全身性TNF-α和IL-6完全降低至基線水平，同時(shí)增加疫苗接種后的下游適應(yīng)性體液反應(yīng)。有數(shù)百種已記錄的免疫佐劑可為疾病提供足夠的保護(hù)，但是無法獨(dú)立調(diào)節(jié)炎癥和副作用限制了它們的使用。研究人員預(yù)計(jì)該框架將使各種TLR激動(dòng)劑能夠安全地用于人類疫苗中，從而增加適應(yīng)性免疫譜的多樣性，并擴(kuò)大疾病的預(yù)防和治療范圍，同時(shí)這項(xiàng)研究也可能會(huì)有益于新冠疫苗的研發(fā)，尤其是當(dāng)病毒突變成季節(jié)性病毒時(shí)。美迪西在疫苗的安全性評價(jià)等方面積累了多年的經(jīng)驗(yàn)，對于疫苗的研究也從未停下腳步，美迪西會(huì)持續(xù)關(guān)注此項(xiàng)研究進(jìn)展，希望可以為疫苗的優(yōu)化和研發(fā)助力。