上海美迪西的生物部在體外生物學(xué)領(lǐng)域有豐富廣泛的經(jīng)驗，通過酶水平測定、細(xì)胞水平測定、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、體外同位素測定、穩(wěn)定細(xì)胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術(shù)等，提供一套完整的生物學(xué)服務(wù)。

在細(xì)胞生物學(xué)研究中，有時要對細(xì)胞膜分子、胞內(nèi)分子或表達產(chǎn)物進行定性或／和定量。但由于靶蛋白表達水乎不太高，用細(xì)胞裂解液或表達上清進行SDS-PAGE電泳、免疫印跡（Western blot）檢測很難達到實驗?zāi)康摹榇丝捎锰禺愋宰R別靶蛋白的抗體進行免疫沉淀，純化和富集靶抗原。免疫沉淀所獲得的蛋白可進行SDS－PAGE電泳，經(jīng)考馬氏亮藍(lán)染色或銀染后觀察目的蛋白條帶。如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考馬氏亮藍(lán)染色或銀染的檢測下限，可采用 Western blot檢測方法，提高檢測的靈敏度，達到實驗?zāi)康摹?

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(westernblot)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

免疫印跡法分三個階段進行。
第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。
第二階段為電轉(zhuǎn)移：將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。第三階段為酶免疫定位：將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。
 

一、蛋白免疫實驗原理 

印跡法：將生物大分子物質(zhì)通過不同的途徑轉(zhuǎn)移到固相載體上，轉(zhuǎn)移后的固相載體經(jīng)淬滅試劑處理后，用適當(dāng)?shù)娜芤浩矗糜诤孜锘蛱结樀娜芤褐蟹跤膳c對于的探針反應(yīng)，顯出特異條帶。
常見的印記法有Southern、Northern、Western印跡法，分別用于檢測DNA、RNA和蛋白質(zhì)。其中Western印記又稱為免疫印跡。
其中，免疫印跡的基本原理是將凝膠電泳與固相免疫相結(jié)合，其主要的操作分為三個過程：
1)電泳：SDS-PAGE分離各蛋白組分；
2)印記：將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體；
3)免疫檢測：依次與一級抗體和標(biāo)記的二抗體反應(yīng)，通過底物或激發(fā)光激發(fā)顯色，觀察目的條帶的有無。

Western Blotting 是用來檢測蛋白質(zhì)的一種技術(shù)。
首先將含有待測蛋白的蛋白質(zhì)混合物進行凝膠電泳分離，然后將已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)通過電泳技術(shù)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上，這一固體支持物目前常為硝酸纖維素薄膜。隨后以待測蛋白質(zhì)上抗原決定簇特異性的抗體（稱為第一抗體）為探針，與固體支持物上的蛋白質(zhì)進行免疫反應(yīng)，最后用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶的抗第一抗體的抗體（第二抗體）與第一抗體進行免疫反應(yīng)，只有與第一抗體特異性結(jié)合的待測蛋白才能與第二抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。在有辣根過氧化物酶的底物用顯色劑存在時就會出現(xiàn)顏色反應(yīng)，結(jié)合有第一抗體、第二抗體的待測蛋白，通過顏色反應(yīng)即能顯現(xiàn)出來。
電泳將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上是通過電轉(zhuǎn)移儀器完成的。它是將固體支持物面對陽極、凝膠面對陰極，二者結(jié)合在一起，然后將外面二側(cè)用Whatman 3MM濾紙結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，放入電轉(zhuǎn)移儀器上，加入電泳緩沖液，通上電源后，蛋白質(zhì)即可從凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物上。

二、蛋白免疫操作步驟

1、蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移
戴上手套，取下SDS-PAGE凝膠，小心剝離凝膠。裁剪與凝膠同樣大的硝酸纖維素薄膜和六層Whatman 3MM濾紙，在硝酸纖維素薄膜左下角剪去一角作為標(biāo)記。將硝酸纖維素薄膜漂浮于去離子水的表面，使水從膜的下部浸透以去除其間氣泡，將Whatman 3MM濾紙在電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕，用蒸餾水淋洗石墨電極，先將三層浸濕的濾紙放在陽極上，在濾紙表面滾動玻璃棒以除去其間的氣泡，再將浸濕的硝酸纖維素薄膜小心平鋪在濾紙上，用玻璃棒小心去除氣泡。隨后將12%SDS-PAGE凝膠舒展平鋪在硝酸纖維素薄膜上，用玻璃棒小心去除氣泡，再將三層浸濕的濾紙平鋪在凝膠上，沁心去除氣泡，最后加上石墨電極板，接通電源進行電轉(zhuǎn)移，電流的大小由凝膠的大小決定，為0.65mA/平方厘米。電轉(zhuǎn)移2小時后，停止通電，卸掉電轉(zhuǎn)移裝置，取下凝膠進行考馬斯亮蘭染色，以檢測電轉(zhuǎn)移是否完全。小心取下硝酸纖維素薄膜，放在一張干濾紙上，吸干30-60分鐘后，開始進顯色反應(yīng)。
2、顯色反應(yīng)
首先進行分子量標(biāo)記的氨基黑染色。切下轉(zhuǎn)有分子量標(biāo)記的硝酸纖維素薄膜，用含有0.3%吐溫20的PBS緩沖液漂洗三次后（每次15分鐘），再將其浸入氨基黑染液中，室溫染色5分鐘，然后置于氨基黑脫色液中脫去背景，水中漂洗后景干備用。
轉(zhuǎn)有樣品的硝酸纖維素薄膜用含有5%脫脂牛奶的PBS緩沖液在室溫下封閉2小時，同時1：100加入兔抗GST第一抗體，平緩搖動，室溫保溫1小時。然后用PBS緩沖液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次  30分鐘。將辣根過氧分物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 體用封閉液稀釋50倍后，加入吐溫20至終濃度為0.05%，然后與上述漂洗的硝酸纖維素薄膜進行反應(yīng)，將膜浸于其中，平放在平緩搖動的搖床平臺上，室溫溫育  1小時后，用PBS緩沖液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次5分鐘，再加入4-氯萘酚顯色液，加入 5μ1 的30%H2O2，將硝酸纖維素薄膜置于其中緩慢搖動，待所檢測的蛋白帶顯色達到最深程度后，將硝酸纖維素薄膜轉(zhuǎn)入 PBS 溶液中停止顯色反應(yīng)。取出硝酸纖維素薄膜，自然晾干后拍照保存結(jié)果。

三、免疫印跡技術(shù)的注意事項

1、免疫印跡技術(shù)所測定的只是目的蛋白的相對含量。因此不能確定一種細(xì)胞含有多少目的蛋白，只能確定該蛋白存在與否及其它條件下與其他細(xì)胞相比蛋白的含量是高還是低。
2、比較一種目的蛋白在不同細(xì)胞或者同一細(xì)胞不同條件下的相對含量時，各樣平的總蛋白量必須相等。
3、選用合適的 SDS-PAGE 膠濃度，使目的蛋白可以得到較好的分辨。
4、開始電泳和轉(zhuǎn)移欠，一定要確認(rèn)電極的正負(fù)極接頭是否正確。
5、在免疫檢測中，要注意封閉非特異性結(jié)合位點。
6、抗體反應(yīng)在封口塑料袋內(nèi)進行，一定要取出袋內(nèi)的所有旗袍，否則會導(dǎo)致抗體結(jié)合不均勻。
7、操作要輕柔，帶手套，不要再轉(zhuǎn)移抹上造成任何刮痕。在整個操作中，轉(zhuǎn)移膜要始終在液體中，不能干燥。 

聯(lián)系我們

郵箱：marketing@medicilon.com.cn

電話：02158591500

相關(guān)內(nèi)容推薦