熒光原位雜交可用來檢測細胞內特定的DNA或RNA，從而判斷特定基因的表達和定位，也可用來檢測腫瘤或其他疾病發生或進行中的染色體的改變。

FISH（Fluoresence In Situ Hybridization）技術是80年代開始發展起來的一種新的定位技術。在人類基因組研究中得到了廣泛的應用．通過中期染色體的FISH可以進行SCP，Cosmid和YAC的染色體定位，嵌合克隆的鑒別，通過間期核的FISH可以在50kb的分辨率下進行基因作圖，最新的研究進展已可以進行伸展的染色質絲(chromatin fibre)的FISH，直接測量基因的長度、從而達到高精度基因作圖的目的。隨著FISH技術發展，它將在人類以及其它物種基因組研究中發揮更大的作用。

熒光標記的染色體原位雜交技術提供了一種快速而有效的手段，將DNA片段和特定的真核生物細胞的染色體區帶聯系了起來，并將這些DNA片段排序，這是研究DNA順序在染色體上位置的最直接的方法。

探針標記時可采用兩種基本方式：

（1）直接標記法：將熒光分子直接標記于探針DNA／RNA上，雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測。這種方式快速簡捷，由于雜交信號較弱、且不能進一步放大，以前這種方法用得不多，但它有背景少的優點，近來在一些公司的試劑盒中得到應用。

（2）間接標記法：常用的間接法是將一些類似于半抗原(hapten)的標記分子摻入探針分子中。用的較多的試劑有生物素，地谷新(digoxigenin)，二硝基苯(dinitrophenyl，DNP)，氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene，AAF)，汞和磺酸鹽(sulfonate)。就摻入方式來說，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物的形式摻入的，可用切口平移法來進行。現在更多的人開始用隨機引物法。用這兩種方法標記好的探針大小在200一500bp范圍內，是用于雜交的最佳大小。另外，也可以在已知順序的兩個引物之間用PCR法來擴增，或從合適的載體上通過RNA轉錄而來。

1、原理

FISH技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標記或以非放射性物質標記后與靶DNA進行雜交，再通過免疫細胞化學過程連接上熒光素標記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號，從而對標本待測核酸進行定量、定性及定位分析。

2、實驗流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結果分析。

3、特點

原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系，具有以下優點:

首先，從探針的制備雜交來看，生物素和其他標記分子沒有放射性，標記過程和雜交過程沒有污染的危險，比較安全。而且用生物素或其他的標記分子標記好以后的探針分子相當穩定，沒有半衰期的限制，可以長期保存。熒光顯色時間短，不象同位素雜交那樣要求長時間曝光，背景簡單。靈敏度也毫不遜色。

另外，FISH可以用多種顏色同時顯色，這是同位素雜交不可比擬的。這種多色作圖，可以便染色體分帶和探針信號顯不同的顏色而同時觀察；也可以用不同熒光標記不同的探針，以確定探針在染色體上酌相對位置。

缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

4、應用

該技術不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。

I．染色體結構變異與非整倍體的檢測:熒光原位雜交簡化了染色體結構變異的檢測。利用原位雜交可比較容易地檢測出缺失、 附加或替換的染色體。

II．基因擴增和缺失的測:FISH空間分辨率和敏感性使得親本和擴增基因在抗病蟲害細胞中定位成為可能。同時用FISH可定位轉基因植物中外源基因位置和拷貝數,此法在番茄、煙草、大麥、小麥、黑麥等作物中已獲成功。利用 FISH 技術也 可檢測一些與遺傳性疾病相關的基因缺失 ,如成功檢測了 aniridia 疾病(一種虹膜缺失的罕見遺傳異常疾病)患者的缺失基因。

III．FISH 技術為著絲粒結構研究提供了重要手段。同時應用 FISH 技術可直接觀察染色體端粒 ,這簡化了染色體在核內的結構和功能研究。

IV．基因作圖:用 FISH 技術可直接檢測 DNA 在染色體上的位置 ,所確定位置是基因在染色體上實際的物理位置。由于原位雜交不受位點內變異和位點間拷貝數的影響,FISH 技術已成為重復序列和多基因家族作圖的重要手段。

V．染色體RNA和基因組進化研究:染色體的主要成分包括DNA和組蛋白,除此之外，還有非組蛋白和RNA。對這些物質在染色體中分布進行精確定位是研究染色體高級結構和構建染色體模型的關鍵所在。FISH 技術為上述研究提供了有效手段。

熒光原位雜交技術主要應用于以下領域：

細胞的轉錄譜分析

·體內外 RNAi 傳遞和基因敲除

·生物標記物研究

·報告基因篩選

·分子病理學

·干細胞分化

·細胞生物學

·神經生物學

隨著標記手段、檢測試劑以及熒光觀察等技術的發展，染色體FISH的應用范圍在不斷拓寬，激光共執聚焦顯微技術的發展，使得核的三維重建可以在計算機的輔助下得以實現。染色體FISH不僅可用來定位基因，而且可用以研究基因在間核中的位置。

相關內容推薦