前言

生物分析能力是藥物臨床前研究和臨床研究的基石能力，是美迪西這類CRO機(jī)構(gòu)助力國內(nèi)外客戶順利推進(jìn)藥物開發(fā)進(jìn)程的技術(shù)基礎(chǔ)。生物分析雖然是一門技術(shù)性很強(qiáng)實(shí)踐性很強(qiáng)的工作領(lǐng)域，如果僅就分析看分析，僅就技術(shù)本身思考技術(shù)對于研發(fā)過程中遇到各種情況和問題的解決可能會(huì)帶來思路上的局限性。做好生物分析工作，離不開技術(shù)實(shí)踐，更離不開相關(guān)基礎(chǔ)理論知識(shí)的支撐，實(shí)踐反饋理論，理論指導(dǎo)實(shí)踐，一些基礎(chǔ)理論不僅具指導(dǎo)價(jià)值，有時(shí)也具啟發(fā)性，有利于廣拓視角。美迪西美研小編團(tuán)隊(duì)推出生物分析系列專欄，邀請本領(lǐng)域的資深專業(yè)人員從不同的視角筆談生物分析相關(guān)的話題。

目前熱門和已上市的核酸藥物主要包括mRNA和寡核苷酸兩大類，mRNA既可以作為為疫苗，又可以作為治療性藥物，需要差異性地考慮其PK/PD的評估策略；寡核苷酸目前成藥的主要是ASO和siRNA，這些核酸藥物又兼顧了小分子與大分子藥物的一些PK/PD特征。

Part.1

基因治療與核酸類藥物

基因治療目前有多個(gè)不同層面的理解，狹義基因治療一般定義是使用正常的基因替代、糾正異常的基因，或者將異常的基因敲除以達(dá)到治療疾病的目的。基于中心法則上去理解，狹義的基因治療也可以從另一個(gè)層面定義為通過糾正中心法則過程中出現(xiàn)的問題，如基因突變導(dǎo)致的功能性蛋白質(zhì)缺失或異常等（參見圖1和圖2），以達(dá)到治療疾病的目的。在廣義的基因治療概念下，溶瘤病毒、細(xì)胞治療，核酸類藥物均可被納入基因治療的范疇，但并不是所有的核酸藥物都屬于基因治療范疇，如mRNA藥物僅有一部分可以被納入基因治療的范疇。

圖1. 基因突變影響開放閱讀框而不能形成有功能的蛋白

圖2. 部分寡核苷酸藥物針對的遺傳病

目前的基因治療領(lǐng)域有兩個(gè)離不開核酸的有趣的現(xiàn)象，即RNA干擾和CRISPR基因編輯。RNA干擾和CRISPR基因編輯也都是一種生物體內(nèi)抗病毒感染的免疫機(jī)制，是在核酸水平上的免疫，有人稱其為基因免疫或基因組免疫。而經(jīng)典的免疫學(xué)里涉及的免疫系統(tǒng)中的免疫分子包括抗體、補(bǔ)體、配體、受體和細(xì)胞因子等成分一般都是氨基酸為基本組成單元的分子，沒有核苷酸作為基本組分的分子的直接參與。

未來是否有更多類似于RNA干擾和基因編輯的核酸層面的機(jī)制被發(fā)掘而可能會(huì)進(jìn)一步地豐富我們對免疫學(xué)的認(rèn)知，并且在基因組免疫領(lǐng)域的概念會(huì)越來越豐富、發(fā)展，甚至逐步成為免疫學(xué)的一大分支，或許也能作為我們的一種額外期待。

核酸藥物經(jīng)過幾十年的積累，在近幾年達(dá)到了爆發(fā)期。目前國內(nèi)外上市的基因治療藥物主要是mRNA疫苗和主要針對遺傳病的寡核苷酸類藥物（如圖3）。所以本文主要將核酸類藥物分為mRNA藥物和寡核苷酸藥物兩類，分別進(jìn)行簡要闡述。

圖3. 國際上市的主要核酸類藥物（截至2023年3月，暫未列國內(nèi)廠家產(chǎn)品）

Part.2

mRNA類產(chǎn)品的PK/PD考察策略

mRNA藥物的優(yōu)勢包括：

（1）可以導(dǎo)入細(xì)胞，在體內(nèi)直接表達(dá)目的蛋白；

（2）mRNA的降解通過細(xì)胞正常代謝完成，無明顯的毒性；

（3）既能刺激體液免疫，又能刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答；

（4）既可以開發(fā)為疫苗，又可以開發(fā)為治療性藥物等。

mRNA藥物的缺點(diǎn)包括：

（1）不穩(wěn)定，易被核酸酶等降解；

（2）制備工藝復(fù)雜；

（3）使用純生物藥的生產(chǎn)路徑；

（4）需要超低溫運(yùn)輸?shù)取?/p>

制定mRNA產(chǎn)品臨床前藥代動(dòng)力學(xué)藥效學(xué)（PK/PD）考察分析策略的前提是判斷其屬于疫苗還是治療性藥物。兩者存在以下不同：

（1）編碼蛋白的性質(zhì)不同，mRNA疫苗編碼病毒或腫瘤抗原蛋白，一般少量蛋白表達(dá)就可以發(fā)揮作用, 治療性藥物則通常需要更高的蛋白表達(dá)量；

（2）遞送要求不同，疫苗無需組織特異性，mRNA治療性藥物則期望遞送到特定的組織后進(jìn)行翻譯表達(dá)；

（3）給藥方式不同，目前上市和在研mRNA疫苗多為肌肉注射，治療性藥物則根據(jù)具體治療性質(zhì)常采用系統(tǒng)給藥，甚至靶組織局部給藥；

（4）遵循的法規(guī)不同，mRNA疫苗需要遵循疫苗的指導(dǎo)原則，免疫原性屬于其PD指標(biāo)，而治療性藥物則不同的遵循，免疫原性也非是研發(fā)者所期望。

mRNA疫苗可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病毒或細(xì)菌蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性抗體，或者表達(dá)腫瘤新生抗原，從而制備個(gè)性化腫瘤疫苗。部分mRNA疫苗如針對基因突變產(chǎn)生的腫瘤新生抗原開發(fā)的疫苗，可以被認(rèn)為是基因治療產(chǎn)品。但另一部分mRNA疫苗表達(dá)病毒抗原如新冠疫苗可直接表達(dá)SARS-CoV-2的刺突蛋白或刺突蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，一般不認(rèn)為是基因治療產(chǎn)品，故如前所述只是部分mRNA產(chǎn)品屬于基因治療范疇。

mRNA疫苗臨床前PK/PD考察分析的要素主要有：

（1）預(yù)防用生物制品的指導(dǎo)原則中指出疫苗通常不需要進(jìn)行常規(guī)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，但某些特殊類型疫苗應(yīng)需要進(jìn)行生物分布的研究；

（2）非臨床研究中，需要研究mRNA和脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）或其它脂質(zhì)成分是否在接種疫苗的組織中分布，它們分布在哪些組織中，以及它們的持續(xù)時(shí)間。

（3）作為疫苗一般不用分析表達(dá)產(chǎn)物，但其表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性相當(dāng)于其重要的藥效指標(biāo)。

基于mRNA疫苗的機(jī)制和效果，對于免疫原性方面，既要考慮結(jié)合抗體又要考慮中和抗體，不僅考慮B細(xì)胞免疫還要考慮細(xì)胞免疫（參見圖4），與治療性藥物相比，mRNA疫苗的免疫原性很強(qiáng)，一般不需要使用高成本高靈敏的檢測技術(shù)進(jìn)行結(jié)合抗體的檢測。

圖4. mRNA疫苗作用機(jī)制示意圖

mRNA治療性藥物有如下效用方式：

（1）抗體效用，即直接表達(dá)用于治療當(dāng)前和新發(fā)疾病的預(yù)防性或治療性抗體；

（2）蛋白替代療法，即直接表達(dá)一種人類蛋白來解決遺傳疾病，如血友病；

（3）基因編輯/堿基編輯，即表達(dá)基因組編輯蛋白或堿基編輯蛋白來修飾人類基因表達(dá)。

mRNA治療性藥物通過編碼功能性治療蛋白，由所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物發(fā)揮治療作用。該類藥物的臨床前PK/PD分析需要有以下兩個(gè)考慮點(diǎn)：

（1）PD的持續(xù)與mRNA產(chǎn)物的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)相相關(guān)，即存在一定的量效關(guān)系；

（2）藥物的PK研究如吸收和分布的研究有利于評價(jià)量效關(guān)系。

mRNA治療性藥物的臨床前PK/PD分析需要考查的要素有：

（1）PK分析：即mRNA濃度隨時(shí)間變化的分析；

（2）將表達(dá)產(chǎn)物，即目標(biāo)蛋白的表達(dá)量與分布作為PD指標(biāo)進(jìn)行分析；

（3）脂質(zhì)體成分的藥代分布分析，尤其是新型脂質(zhì)輔料。

此外，PK/PD與免疫原性間通常具有關(guān)聯(lián)性，對于mRNA治療性藥物需要同時(shí)分析mRNA本身和脂質(zhì)體成分的免疫原性影響，聚乙二醇化LNP產(chǎn)生抗體已有報(bào)道，抗PEG抗體已被廣泛研究和報(bào)道，筆者所在機(jī)構(gòu)也分析出LNP的PEG成分可見一定程度的免疫原性，筆者所在機(jī)構(gòu)表達(dá)IgG1亞型抗體的治療性mRNA產(chǎn)品在食蟹猴靜脈給藥的PK/PD試驗(yàn)例中全面兼顧了本文所列要點(diǎn)。

圖5. mRNA治療性藥物的PK/PD研究設(shè)計(jì)實(shí)施例

Part.3

寡核苷酸類產(chǎn)品的PK/PD考量

目前寡核苷酸類產(chǎn)品成藥上市的主要為反義寡核苷酸（ASO）與siRNA，而miRNA研發(fā)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的極少，所以本部分的分析僅以ASO與siRNA藥物為代表。ASO和siRNA的主要區(qū)別在于，前者是單鏈，后者是雙鏈RNA。而雙鏈的siRNA作用機(jī)制與RISC形成有關(guān)，RISC可反復(fù)作用靶標(biāo)mRNA； siRNA被釋放的正義鏈或被降解，也可作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶的催化下以靶mRNA為模板擴(kuò)增得到dsRNA，dsRNA又可被Dicer降解成siRNA，進(jìn)入RNAi循環(huán)，所以藥物效果更持久甚至有級聯(lián)放大效果。

寡核苷酸類藥物的PK特征包括：

（1）靜脈給藥和其它途徑給藥，藥物進(jìn)入靶部位的方式不同，導(dǎo)致體內(nèi)的PK過程也不一樣；

（2）裸siRNA不穩(wěn)定，易被血液和組織中核酸酶降解；

（3）容易在肝臟和腎臟中聚集，并經(jīng)腎臟排泄；

（4）非腦內(nèi)給藥時(shí)，不易過腦；

（5）兩條鏈被修飾的方式不一樣，導(dǎo)致兩條鏈的PK參數(shù)比如峰濃度和暴露量不一致；

（6）在給藥局部存留時(shí)間長；

（7）血液清除速度要快于組織；

（8）目前的藥物基本都為體外合成的RNA分子，可被免疫系統(tǒng)吞噬，有些還會(huì)激活天然免疫，如toll樣受體參與引發(fā)免疫反應(yīng)，比如干擾素（IFN-α、IFN-β)、細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6）產(chǎn)生等。寡核苷酸藥物主要經(jīng)核酸內(nèi)或外切酶代謝為短核苷酸碎片，和蛋白類藥物被蛋白酶切割降解為氨基酸類似，所以寡核苷酸藥物與傳統(tǒng)大分子藥物的代謝上有雷同之處，但許多寡核苷酸現(xiàn)實(shí)又多見修飾，其代謝產(chǎn)物分析仍需周全考慮；另其分子量是遠(yuǎn)大于小分子和一些多肽，分子量較大，需要考慮免疫原性潛在的對其PK/PD特征的影響。

寡核苷酸類藥物PK/PD考察分析的策略要點(diǎn)主要包括：

（1）按照小分子藥物PK研究思路設(shè)計(jì)相關(guān)研究內(nèi)容；

（2）兼顧其大分子藥物的部分特征，考慮免疫原性的影響，如抗藥物抗體（ADA）的分析，考慮代謝清除緩慢的特點(diǎn)；

（3）對于siRNA，分析反義鏈和有義鏈所表征的PK行為是否有差異；

（4）必要時(shí)，注意考察制劑輔料的PK特點(diǎn)；

（5）設(shè)置相應(yīng)PD指標(biāo)，如新功能蛋白的水平變化;

（6）適當(dāng)設(shè)置細(xì)胞因子、補(bǔ)體等PD生物標(biāo)志物指標(biāo)，針對輔料如PEG的抗體檢測;

（7）利用合適平臺(tái)技術(shù)開發(fā)滿足實(shí)際靈敏度需求且穩(wěn)定的PK生物分析方法是一大挑戰(zhàn)。

分析寡核苷酸類藥物的PK/PD，離不開對其免疫原性的察。因?yàn)楣押塑账犷愃幬锸峭庠葱院怂岱肿樱肿恿科螅⑶沂菨撛诘娜蹩乖虬肟乖６庖咴援a(chǎn)生的主要原因可能與其產(chǎn)品因素、產(chǎn)品的藥理學(xué)因素以及給藥對象因素有關(guān)，藥理學(xué)因素以及給藥對象因素具體機(jī)制與其它大分子的這兩方面因素大致相同，重點(diǎn)要考慮該類產(chǎn)品潛在引起免疫原性的本身的產(chǎn)品因素的不同如鏈型、堿基序列、堿基修飾、遞送載體成分、骨架修飾等。免疫原性的考察點(diǎn)的考慮基于siRNA等寡核苷酸的外源性性質(zhì)，宿主系統(tǒng)會(huì)將其視為病原體，免疫系統(tǒng)可以通過細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)不同的病原相關(guān)分子模式（PAMP）受體識(shí)別單鏈和雙鏈RNA與toll樣受體（TLRs）相互作用產(chǎn)生免疫應(yīng)答；以及TLRs刺激炎癥細(xì)胞因子和I型干擾素（IFN）的過量產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。既要考慮體液免疫分析，又要考慮除寡核苷酸本身外的載體成分，甚至藥效機(jī)制發(fā)揮而生成的新的功能性蛋白成分的免疫原性。

Part.4

分析策略與技術(shù)應(yīng)用

核酸類藥物尤其是寡核苷酸類藥物，對生物分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)。寡核苷酸類藥物的分子量不大不小、并存在藥物不穩(wěn)定、鏈型、修飾、弱免疫原或半抗原（導(dǎo)致特異陽性抗體的制備存在現(xiàn)實(shí)困難）等特征，這些都是構(gòu)成其分析挑戰(zhàn)的幾大因素。

目前主要有5種主流技術(shù)可以進(jìn)行核酸類藥物的PK分析，包括PCR技術(shù)、H-LBA、b-DNA、基于雜交的LC-UV/PL以及LC-MS/MS和LC-HRMS（圖6）。

其中，qPCR技術(shù)可以方便地檢測長度較長的核酸類藥物，靈敏度高，檢測范圍寬，但是需要復(fù)雜的樣品處理過程；ddPCR靈敏度更高，但耗材費(fèi)用高，成本高；對于較短的核酸檢測來說，雖然也可以通過莖環(huán)qPCR（Stem-Loop qPCR）的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)，實(shí)施相對于較大的核酸要復(fù)雜。H-LBA方法的特異性高，靈敏度好，但是檢測效果非常依賴于探針的可靠性和設(shè)計(jì)技巧及反應(yīng)過程細(xì)節(jié)的優(yōu)化；b-DNA方法其實(shí)是H-LBA技術(shù)的拓展版，有很高的特異性、準(zhǔn)確性和更高的靈敏度，但檢測效果同樣高度依賴于特殊的探針設(shè)計(jì)及雜交反應(yīng)技術(shù)細(xì)節(jié)；基于雜交的LC-UV/FL方法可以測定較長核酸類藥物，具備較好的特異性和準(zhǔn)確性，但是樣品處理復(fù)雜，靈敏度對熒光探針的準(zhǔn)確性高度依賴；LC-MS/MS和LC-HRMS方法也可以用于核酸類藥物的分析，選擇性好，可以區(qū)分全長和代謝產(chǎn)物，但是對非修飾的寡核苷酸類藥物檢測靈敏度和特異性相對較差，并且價(jià)格昂貴，不適宜測過長的核酸分子。其它的活體熒光成像，同位素示蹤、原位雜交、熒光原位雜交等分析技術(shù)可以作為補(bǔ)充手段，應(yīng)用于不同的目的和研究階段，但它們的精準(zhǔn)度差，不大適合作為后續(xù)的驗(yàn)證用方法。

圖6. 核酸類藥物生物分析的主流技術(shù)對比

總結(jié)

近年來，核酸類藥物是近幾年來最熱門一大新藥研究方向。但核酸類藥物尤其是寡核苷酸類藥物與傳統(tǒng)小分子與大分子藥物成分存在顯著區(qū)別，給核酸類藥物的生物分析和PK/PD考察帶來了較大的技術(shù)挑戰(zhàn)。mRNA藥物作為疫苗和治療性藥物時(shí)考慮點(diǎn)不同，寡核苷酸類藥物同時(shí)兼顧了大小分子的一些PK/PD特征，需要根據(jù)具體的分子特征選擇PK/PD考察評估策略和分析的技術(shù)應(yīng)用策略。

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