前言

生物分析能力是藥物臨床前研究和臨床研究的基石能力，是美迪西這類CRO機(jī)構(gòu)助力國內(nèi)外客戶順利推進(jìn)藥物開發(fā)進(jìn)程的技術(shù)基礎(chǔ)。生物分析雖然是一門技術(shù)性很強(qiáng)實(shí)踐性很強(qiáng)的工作領(lǐng)域，如果僅就分析看分析，僅就技術(shù)本身思考技術(shù)對于研發(fā)過程中遇到各種情況和問題的解決可能會帶來思路上的局限性。做好生物分析工作，離不開技術(shù)實(shí)踐，更離不開相關(guān)基礎(chǔ)理論知識的支撐，實(shí)踐反饋理論，理論指導(dǎo)實(shí)踐，一些基礎(chǔ)理論不僅具指導(dǎo)價值，有時也具啟發(fā)性，有利于廣拓視角。美迪西美研小編團(tuán)隊(duì)推出生物分析系列專欄，邀請本領(lǐng)域的資深專業(yè)人員從不同的視角筆談生物分析相關(guān)的話題。

感知與反饋調(diào)節(jié)是生命體的一種基本調(diào)節(jié)能力，機(jī)體的感知是實(shí)施反饋調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，機(jī)體各大生理性系統(tǒng)中都存在著這種感知與反饋的能力，如免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等無疑都存在著這種基本的能力。感知與反饋調(diào)節(jié)能力的有些表象可以被生命體直接感受到，而有些表象則比較潛隱，需要一定的檢測分析手段才能發(fā)現(xiàn)與鑒別。

感知與反饋表面上看僅僅是生理學(xué)領(lǐng)域所需要關(guān)注的內(nèi)容而與我們支持藥代動力學(xué)、毒代動力學(xué)以及免疫原性或毒性研究的生物分析領(lǐng)域似乎沒有什么關(guān)系。其實(shí)不然，認(rèn)識到“感知與反饋”，對于生物分析領(lǐng)域的人員在實(shí)踐中思考問題、解決問題、分析問題和解釋最終數(shù)據(jù)都有著重要的啟示性意義。

I 免疫應(yīng)答中“感知與反饋”的啟示

免疫系統(tǒng)能夠感知外來抗原的入侵而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可以針對免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱進(jìn)行反饋和調(diào)節(jié)，這種能力不僅能表現(xiàn)在應(yīng)答的有無，還能表現(xiàn)在對量的變化的感知與反饋上。

對于免疫系統(tǒng)的感知與反饋調(diào)節(jié)能力，在經(jīng)典的免疫學(xué)原理相關(guān)教材中都有系統(tǒng)性描述，其中經(jīng)典的例證就是動物血清交換實(shí)驗(yàn)。家兔經(jīng)某個抗原免疫后，血清中出現(xiàn)了高滴度的抗體，如果用一只未經(jīng)免疫的家兔的血清與之交換，即人為降低了原家兔的抗體濃度，隨后體內(nèi)會出現(xiàn)一個抗體突然升高的現(xiàn)象，然后重新緩慢下降（圖1）。

這種升高，不是因?yàn)榧幼⒘丝乖鴥H僅因?yàn)樵摷彝糜行У馗兄窖逯忻庖邞?yīng)答產(chǎn)物即抗體含量突然下降的濃度變化而迅速引起抗體產(chǎn)生量的反饋性升高，達(dá)一定強(qiáng)度后則逐漸下降。這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的描述生動地呈現(xiàn)了免疫系統(tǒng)中重要的感知與反饋調(diào)節(jié)能力。

Figure 1 機(jī)體對抗體濃度變化的感知與反饋性自我調(diào)節(jié)

機(jī)體免疫系統(tǒng)除了對某抗原產(chǎn)生的抗體濃度變化有感知外，對抗原數(shù)量和濃度變化的反應(yīng)也是其感知的重要方向，有效的免疫應(yīng)答和抗體的產(chǎn)生在很大程度上取決于抗原劑量。生物技術(shù)藥物的生物分析往往依賴于免疫分析的技術(shù)而離不開抗原-抗體的反應(yīng)，因而離不開抗體的制備；經(jīng)常需要考察大分子藥物的免疫原性，也離不開抗體變化水平等分析。

其實(shí)，在機(jī)體內(nèi)的抗體產(chǎn)生過程中，外來的具有免疫原性的物質(zhì)（如藥物）劑量過高或過低均不易誘導(dǎo)相應(yīng)特異性抗體的產(chǎn)生，其背后的因素之一就是免疫系統(tǒng)對抗原的感知有其量上的敏感性，不高不低的適量抗原才能有效激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體，劑量過低會出現(xiàn)低帶耐受，劑量過高則會出現(xiàn)高帶耐受（圖2）。

類似的機(jī)制也與抗抗體的產(chǎn)生以及抗原特異性記憶性細(xì)胞的形成密切相關(guān)，如抗抗體只有當(dāng)抗體數(shù)量積累到一定水平后才能出現(xiàn)，記憶性細(xì)胞的形成依賴于合適濃度的激發(fā)，抗原刺激過弱或過強(qiáng)均不易于誘導(dǎo)出相應(yīng)的抗原特異性免疫。上述這些方面的機(jī)理對在生物分析實(shí)踐中掌握好機(jī)體的抗體形成規(guī)律，實(shí)施好抗原免疫劑量、把握好抗體制備收集的時間規(guī)律，以及分析不同劑量組間免疫原性結(jié)果差異、探究細(xì)胞免疫的能力差異都有一定的理論提示性作用的。

Figure 2：免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體依賴于初次免疫應(yīng)答所用抗原劑量

II “感知與反饋”對藥物免疫原性分析的啟示

在生物分析實(shí)踐中，常會發(fā)現(xiàn)所獲得的免疫原性的數(shù)據(jù)并非和給藥劑量成很好的正相關(guān)性。如果對本文中前一部分知識有所了解，相關(guān)人員可能就不會詫異這樣的數(shù)據(jù)結(jié)果了。因?yàn)樗幬镆蚱涿庖咴运鸬拿庖邞?yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗體與抗原劑量相關(guān)，劑量太高或劑量太低，機(jī)體對免疫原的反應(yīng)并不明顯，所以有時我們看到像下圖（圖3）一樣僅僅是中劑量組產(chǎn)生了較為明顯的抗藥性抗體而影響了藥代動力學(xué)曲線并不必太奇怪。

當(dāng)然圖3是一個出于筆者實(shí)驗(yàn)室的較為典型的例子，有許多情況下，抗藥物抗體的出現(xiàn)規(guī)律并非都如此，因?yàn)樵诮o藥劑量設(shè)計(jì)的時候，并非根據(jù)可能引起免疫應(yīng)答的閾值、強(qiáng)弱或抗原耐受閾值而設(shè)計(jì)動物試驗(yàn)或臨床試驗(yàn)劑量的。如果三個試驗(yàn)劑量組整體劑量都較高，則可能在低劑量組出現(xiàn)較其它劑量組更為明顯的抗藥物抗體產(chǎn)生；如果三個劑量組都很低，則可能到了高劑量組才刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的抗藥物抗體，這種種免疫原性分析結(jié)果的出現(xiàn)的情況都是可能的，因此評判數(shù)據(jù)時也要注意結(jié)合劑量與此機(jī)制動態(tài)地思考和剖析所獲得的免疫原性數(shù)據(jù)。

Figure 3：某抗體藥中劑量因ADA的產(chǎn)生而影響了PK Profile

對免疫原性的影響的上述描述是比較直觀和直接的現(xiàn)象，感知與反饋調(diào)節(jié)不僅僅影響到免疫原性反應(yīng)也可能受到外來成分的免疫毒性的干預(yù)，調(diào)節(jié)機(jī)能不僅能感知到外在藥物濃度的變化，還常伴隨著調(diào)節(jié)因子或受體的參與。具有潛在誘導(dǎo)免疫抑制的藥物有可能通過抑制性免疫相關(guān)調(diào)節(jié)因子或受體等間接作用抑制免疫系統(tǒng)活性，引起免疫抑制，潛在會使應(yīng)答失靈，而可能需要執(zhí)行TDAR等相關(guān)的生物分析考察，甚至分析評價對關(guān)鍵的免疫細(xì)胞的數(shù)量、比例和/或功能的影響。

當(dāng)然，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)活性的藥物可能通過激活免疫相關(guān)調(diào)節(jié)因子或受體等激發(fā)免疫系統(tǒng)活性，反饋調(diào)節(jié)可能失衡，潛在引起免疫毒性相關(guān)的細(xì)胞因子過度釋放而需要進(jìn)行額外的細(xì)胞因子分析工作。這些還需要結(jié)合具體藥物的性質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行考慮。

III “感知與反饋”對的PK分析的啟示

內(nèi)分泌系統(tǒng)是機(jī)體的另一大生理系統(tǒng)，其本身就是神經(jīng)系統(tǒng)外的又一大重要的身體機(jī)能調(diào)節(jié)系統(tǒng)。許多激素類物質(zhì)都是由內(nèi)分泌系統(tǒng)分泌，在全身發(fā)揮著調(diào)節(jié)功能。激素一般以相對恒定速度或一定的節(jié)律釋放，生理或病理因素均可影響激素的基礎(chǔ)性分泌，也由機(jī)體傳感器感知監(jiān)測和調(diào)節(jié)激素水平，反饋調(diào)節(jié)體系是內(nèi)分泌系統(tǒng)中的重要自我調(diào)節(jié)機(jī)制。激素不僅能執(zhí)行常規(guī)的其生理性網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，也對外來自身物質(zhì)或自身類似物質(zhì)的注入很敏感，可以感知自身物質(zhì)濃度的變化而實(shí)行自我反饋調(diào)節(jié)，通過一定的監(jiān)測手段，有時我們可以分析到這樣的變化。

當(dāng)前，許多激素都已經(jīng)被開發(fā)成為了藥用產(chǎn)品，如甲狀旁腺激素（PTH）可用于治療骨質(zhì)疏松，胰島素可以治療糖尿病等皆已眾所周知，還有許多藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)競相開發(fā)或拓展類似的產(chǎn)品。

外源性激素作為藥物被研究開發(fā)有時也給生物分析領(lǐng)域的藥代動力學(xué)分析評價帶了難題和挑戰(zhàn)，因?yàn)樵S多激素類藥物都存在內(nèi)源性對應(yīng)物，這種情況下，分析的方法和手段有時是較為難以區(qū)分內(nèi)外源物質(zhì)的。雖然若采用對外源性激素藥物進(jìn)行同位素標(biāo)記進(jìn)行分析就可以區(qū)分，但并非每一個研究階段都可以適用這種手段；不能區(qū)分的情況下，如果采用假設(shè)給藥前試驗(yàn)個體的內(nèi)源性對應(yīng)物的濃度水平恒定而作為本底扣除的方式或采取扣除統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上得知的受試群體的給藥前內(nèi)源性對應(yīng)物的平均濃度水平的方式都不是很科學(xué)精確，因?yàn)閮?nèi)源性物質(zhì)的分泌往往是動態(tài)的、節(jié)律性的甚至受個體狀態(tài)的影響。分泌激素的內(nèi)分泌細(xì)胞會感知靶細(xì)胞及血中該激素濃度變化的信息,而執(zhí)行使其分泌減少或增加的反饋調(diào)節(jié)，外源性激素引起的濃度變化也是會被感知的。

如果我們預(yù)知有些激素當(dāng)外源性對應(yīng)物注射入機(jī)體以后，內(nèi)源性對應(yīng)物的分泌將會相應(yīng)減少的這一機(jī)體感知與反饋調(diào)節(jié)的規(guī)律，內(nèi)源性對應(yīng)物對藥代動力學(xué)分析影響的擔(dān)憂也就減少甚至可以被忽略。Eli Lilly 的J. Satterwhite等就特立帕肽(Teriparatide)的臨床研究報(bào)道中指出，I期和III期臨床研究的結(jié)果表明，注射特立帕肽后內(nèi)源性甲狀旁腺激素分泌則受到顯著抑制；因此，內(nèi)源性甲狀旁腺激素對甲狀旁腺激素藥物定量分析的干擾可以忽略不計(jì)，也與筆者實(shí)驗(yàn)室就此分析物的研究情況吻合。基于此機(jī)理，內(nèi)源性PTH對生物分析干擾的問題就可從理論和他人實(shí)踐上得到解決與排除。

筆者實(shí)驗(yàn)室在對胰島素進(jìn)行藥代動力學(xué)分析時，也注意并發(fā)現(xiàn)了類似的變化規(guī)律，我們采用兩個高度特異且靈敏的分析方法分別檢測外源性胰島素藥物以及內(nèi)源性胰島素的濃度，明顯發(fā)現(xiàn)隨著外源性對應(yīng)物的注入，內(nèi)源性胰島素會有顯著的減低，隨著外源性對應(yīng)物濃度降低，內(nèi)源性胰島素的水平又逐漸升高，基本上是此消彼長的一個對應(yīng)關(guān)系（圖4），也基本和我們在開展試驗(yàn)前的理論預(yù)期相符合。可能不僅僅是一些激素類有這樣的分泌規(guī)律，也許不排除其它類內(nèi)源性物質(zhì)也有相似的調(diào)節(jié)規(guī)律為我們所利用，值得進(jìn)一步研究。

Figure 4：內(nèi)源性胰島素相應(yīng)于某外源性胰島素藥物的近乎此消彼長的濃度變化

總結(jié)

感知與反饋的這一生理性調(diào)節(jié)機(jī)能普遍存在并且也有許多經(jīng)典的教材對其進(jìn)行描述，生命體的許多方面都涉及到類似的調(diào)節(jié)機(jī)制，其內(nèi)容復(fù)雜多變，但這些復(fù)雜多變的調(diào)節(jié)機(jī)制為藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)，當(dāng)然還有許多機(jī)制未徹底闡明，形式可能多樣，本文結(jié)合筆者所在實(shí)踐領(lǐng)域和所遇案例，僅就此機(jī)制對生物分析實(shí)踐過程中的一點(diǎn)啟示略作淺談，供大家參考。

生物分析所產(chǎn)生的結(jié)果和數(shù)據(jù)趨勢是隨不同因素而異的，在不同情況下會受到不同機(jī)制的影響，因此針對具體研究內(nèi)容在制定預(yù)案、過程實(shí)踐和結(jié)果分析時往往要結(jié)合一些生物學(xué)機(jī)制等基礎(chǔ)理論知識思考，看似這些基礎(chǔ)理論離自己很遙遠(yuǎn)，但對其有所認(rèn)知的話在需要的時候可以給我們拓寬思路，帶來啟示，幫助我們在各項(xiàng)生物分析實(shí)踐中思考、解決或解釋問題和結(jié)果。

譬如此文所提及這方面的現(xiàn)象和機(jī)制提示我們思考具體藥物引起特異性免疫應(yīng)答和抗體分泌的節(jié)律與劑量影響的關(guān)系；又如具體在研藥物內(nèi)源性對應(yīng)物是不是潛在具有類似激素的對外源劑量的感知與反饋調(diào)節(jié)規(guī)律從而減少我們實(shí)踐上的擔(dān)憂或基于此生物學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行一個探索驗(yàn)證以減少或克服后續(xù)的擔(dān)憂；還如除了B細(xì)胞免疫分泌抗體受抗原劑量影響外， T細(xì)胞免疫也同理應(yīng)該能對抗原劑量有其感知能力；另外，有感知即有反饋調(diào)節(jié)，還是兩者在某些情況下是否獨(dú)立的？這種機(jī)能在不同情況下會受什么樣的劑量閾值限制和影響？低于下限劑量閾值而使感知失靈，高于上限閾值劑量而使反饋調(diào)節(jié)失能，甚至一些藥物因?yàn)槟撤矫娑拘曰騽┝慷鴿撛谄茐倪@種感知和反饋調(diào)節(jié)到穩(wěn)態(tài)范圍內(nèi)而需要從研究上補(bǔ)充額外的分析考察項(xiàng)？等等這些可能都需要我們結(jié)合日常實(shí)踐根據(jù)具體案例和具體數(shù)據(jù)進(jìn)行多維度地觀察與思考。

[1]. Satterwhite, J., et al., Pharmacokinetics of Teriparatide (rhPTH[1–34]) and Calcium Pharmacodynamics in Postmenopausal Women with Osteoporosis [J]. Calcified Tissue International, 2010. 87(6): p. 485-492.

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