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哺乳動物蛋白表達系,具備蛋白折疊和翻譯后修飾的功能,使其蛋白更接近天然蛋白,從而獲得與天然蛋白相同的生物活性。因此使得哺乳動物細胞表達系統在重組蛋白藥物,特別是治療性重組單抗藥物的研發和生產中有最為廣泛的應用。
? 亞克隆
? 哺乳動物細胞瞬時表達
? 轉染優化和表達檢測(從1L培養基)
? 蛋白表達
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按照宿主細胞的類型,可將基因表達系統大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞表達系統。與其它系統相比,哺乳動物細胞表達系統的優勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊,提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能,因而表達產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質分子。
哺乳動物細胞表達系統:克隆基因要在哺乳動物細胞中進行表達,必須先將基因重組到適當的真核表達載體中。重組的表達載體在大腸桿菌中進行擴增,并從大腸桿菌中提取和純化重組表達載體,然后將其導入哺乳動物細胞進行表達。在哺乳動物細胞中表達的基因,可以是基因組DNA,也可以是cDNA。
編碼真核蛋白的外源基因在真核細胞中表達時,表達產物對細胞本身的影響不大,蛋白質本身也很少被降解。因此真核表達載體的啟動子大多是可以持續表達的,無需誘導。在篩選出轉染細胞后,持續培養,便可在上清中得到表達產物。
哺乳動物表達系統應用領域:多種基因工程藥物的生產平臺;在新基因的發現、蛋白質的結構和功能研究中亦起了極為重要的作用。
1、昆蟲表達系統
昆蟲是高等真核生物,能進行翻譯后加工和修飾。昆蟲細胞常用于真核蛋白質的生產。其生長速度快,不需要CO2培養箱,易于懸浮培養,可用于大規模表達蛋白質。
桿狀病毒表達系統利用一種不依賴于輔助病毒的病毒,該病毒可在適于懸浮培養的昆蟲細胞中增殖至高滴度,能獲得大量的重組蛋白,大部分超量表達的蛋白質為可溶性蛋白。桿狀病毒對脊椎動物無感染性。
2、酵母表達系統
酵母菌是一種單細胞真核生物,能進行翻譯后加工和修飾。酵母菌在特定的培養基中生長迅速,與哺乳動物細胞相比,易于操作和價格便宜。酵母表達系統是大規模表達重組真核蛋白的理想工具。
①部分蛋白在哺乳動物細胞中的表達已從實驗室研究邁向生產或中試生產階段。 ②已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動物細胞系統表達和大量制備、生產。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素、人抗凝血素Ⅲ,集落刺激因子等。有些產品已投入臨床應用或試用。 ③雖然經過多年努力,哺乳動物細胞表達系統的表達水平有大幅度增高,但從整個水平上看仍偏低,一般處在雜交瘤細胞單克隆抗體蛋白產率的下限,即1-30μg/l08細胞/24小時。有人認為其限速步驟可囂是在工程細胞中(對于重組蛋白來講,常是異源的),重組蛋白的分泌效率較低。