酵母雙雜交技術原理、試驗流程、特點以及應用

2016-01-20

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在生命活動中，DNA的復制、轉錄、RNA的剪接、蛋白質的翻譯和分泌以及細胞周期的調節、信號傳導和諸多代謝過程都是各種相關蛋白質有機相互作用的結果。細胞或組織中的蛋白質不是雜亂無章的混合物，蛋白質間的相互作用、相互協調是細胞進行一切代謝活動的基礎。隨著分子生物學實驗技術的飛速發展，近10年來，發展了一些研究蛋白--蛋白相互作用的方法，其中以Fields和Song創立的酵母雙雜交技術為最佳。該方法利用酵母生長速度快，且容易操作的特點，在其體系中研究哺乳動物細胞的蛋白--蛋白間的相互作用，通過篩選cDNA文庫，找到與感興趣蛋白相互作用的蛋白。

酵母雙雜交原理

酵母雙雜交系統的建立得力于對真核細胞調控轉錄起始過程的認識。研究發現，許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結構域(domain)組成的。例如，酵母的轉錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結合域(DNA binding domain,BD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA結合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結合，而轉錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉錄。但是，單獨的DNA結合域不能激活基因轉錄，單獨的轉錄激活域也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄激活因子的功能。

酵母雙雜交試驗流程

酵母雙雜交系統正是利用了GAL4的功能特點，通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來捕獲新的蛋白質，其大致步驟為:
①視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結合域融合，構建成誘餌質粒。
②將待篩選蛋白的cDNA序列與轉錄激活域融合，構建成文庫質粒。
③將這兩個質粒共轉化于酵母細胞中。
④酵母細胞中，已分離的DNA結合域和轉錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達，便可捕捉到新的蛋白質。

酵母雙雜交特點

優點:蛋白--蛋白相互作用是細胞進行一切代謝活動的基礎。酵母雙雜交系統的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。
缺點:盡管該系統己被證實為一種非常有效的方法，但它也有自身的缺點和問題。1、它并非對所有蛋白質都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進入細胞核內。因為融合蛋白相互作用激活報告基因轉錄是在細胞核內發生的。2、假陽性的發生較為頻繁。所謂假陽性，即指未能與誘餌蛋白發生作用而被誤認為是陽性反應的蛋白。而且部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質的作用有關。3、在酵母菌株中大量表達外源蛋白將產生毒性作用，從而影響菌株生長和報告基因的表達。

使用酵母雙雜交技術應注意的問題
真正明了酵母雙雜交技術的主要原理及篩選方法是進行酵母雙雜交實驗的前提，構建成功的誘餌質粒及大量的材料準備是進行酵母雙雜交實驗的保證。只有明了雙雜交的原理，才有可能設計實驗進程、才能有目的的進行材料準備，并能對實驗結果作出預測與分析，尤其要對具體實驗中各種選擇性壓力培養基的使用目的要十分清楚。大量的材料準備、較長的實驗流程是酵母雙雜交有別于其他實驗的特點，而其操作技術本身并不十分困難。特別應提出的是，一個陽性克隆的編號往往要被反復記錄多次，因此，要時時注意編號的正確性。另外，若從公司購得待篩選的酵母cDNA文庫，應注意不同的公司有不同的產品，且各公司的產品不斷更新換代，要認真閱讀實驗指導手冊，以防出現失誤。