泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）功能紊亂與多種疾病的發(fā)生具有密切關(guān)系，包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。因此，UPS已經(jīng)成為相關(guān)疾病治療的熱門靶點(diǎn)之一。抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，調(diào)控相關(guān)底物蛋白的降解，實(shí)現(xiàn)疾病治療是重要的藥物開發(fā)策略，目前靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的小分子抑制劑研究主要有泛素活化酶E1抑制劑、泛素結(jié)合酶E2抑制劑、泛素連接酶E3抑制劑以及蛋白酶體抑制劑等。
TAK-243是一種首創(chuàng)的（First-in-Class）、高效的泛素活化酶E1 (UAE) 抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)TAK-243具有顯著的抗腫瘤活性。其中，科研人員通過美迪西使用HCC-70模型進(jìn)行體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制率(TGI)達(dá)到91%。本篇文章結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和美迪西藥效部門的經(jīng)驗(yàn)，分享泛素化抑制劑研發(fā)的藥效研究案例，希望對(duì)關(guān)注泛素化研究和腫瘤藥效的各位科研工作者有所幫助。
泛素化
泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分解，從中選出靶蛋白分子，并對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用，也參與了細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、損傷修復(fù)、免疫炎癥等眾多生命活動(dòng)的調(diào)控。
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)
泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (Ubiquitin-Proteasome System，UPS) 是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)降解的多組分系統(tǒng)，介導(dǎo)真核生物80%以上的蛋白質(zhì)降解，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化、DNA復(fù)制與修復(fù)、細(xì)胞代謝、免疫反應(yīng)等。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）主要由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3、去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUBs）和26S蛋白酶體組成。
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS)[1]
泛素（ubiquitin，Ub）
泛素是一種廣泛分布在真核細(xì)胞中的高度保守的小分子蛋白。單個(gè)泛素分子由76個(gè)氨基酸殘基組成。主要功能是標(biāo)記需要分解掉的靶蛋白，使其被26S蛋白酶體降解。泛素還可以標(biāo)記跨膜蛋白，參與蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。
泛素結(jié)構(gòu)圖（來源：Wikipedia）
泛素活化酶（E1）
泛素活化酶,也稱為E1酶，是泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個(gè)酶，在結(jié)構(gòu)上含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基，通過半胱氨酸殘基與泛素的C端形成高能硫酯鍵而激活泛素。對(duì)于調(diào)節(jié)泛素穩(wěn)態(tài)和下游泛素化依賴性細(xì)胞過程（包括通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白水解和選擇性自噬）具有重要作用。
泛素結(jié)合酶（E2）
在泛素化過程中，泛素結(jié)合酶E2發(fā)揮非常重要的作用，是其中必不可少的中間環(huán)節(jié)。泛素結(jié)合酶E2是由許多蛋白質(zhì)所組成的超家族，結(jié)構(gòu)和功能方面都存在多樣性。所有的泛素結(jié)合酶都含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域——UBC結(jié)構(gòu)域。泛素結(jié)合酶 (E2) 將泛素從泛素活化酶 (E1) 轉(zhuǎn)運(yùn)到泛素連接酶 (E3) 和底物中起關(guān)鍵作用。
泛素連接酶（E3）
泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的第三個(gè)酶，催化將結(jié)合在泛素結(jié)合酶上的泛素傳遞給目標(biāo)蛋白質(zhì)，泛素連接酶E3決定靶蛋白的特異性識(shí)別，在泛素化途徑中具有重要作用。泛素連接酶E3通過調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過程參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程。所有的E3都具有連接靶蛋白和特定E2的能力。泛素連接酶E3結(jié)構(gòu)域主要包括HECT結(jié)構(gòu)域、RING結(jié)構(gòu)域和U-box結(jié)構(gòu)域。正是由于這些復(fù)雜多變的E3家族成員可以對(duì)不同底物進(jìn)行特異性識(shí)別，泛素化途徑才呈現(xiàn)出蛋白降解的高度選擇性。
去泛素化酶（DUBs）
去泛素化酶家族負(fù)責(zé)通過水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵，將泛素分子特異性的從鏈接有泛素的蛋白質(zhì)或者前體蛋白水解下來，起到去泛素化的作用，對(duì)蛋白降解進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，從而影響蛋白質(zhì)的功能。
蛋白酶體 （Proteasome）
26S蛋白酶體是降解泛素化底物的ATP依賴型蛋白水解復(fù)合體，由20S核心顆粒、19S調(diào)節(jié)顆粒和11S調(diào)節(jié)因子構(gòu)成。26S蛋白酶體是泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的中心蛋白酶。通過控制參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白的降解，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。 蛋白酶體具有多種功能，是藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)，特別是在腫瘤和神經(jīng)退行性疾病中。在過去的二十年中已經(jīng)鑒定了許多選擇性蛋白酶體抑制劑并批準(zhǔn)用于臨床（如：Bortezomib，Carfilzomib等）。
26S蛋白酶體結(jié)構(gòu)（來源：Wikipedia）
泛素化過程
? 在ATP供給能量的情況下，泛素活化酶E1將泛素分子活化；形成E1-泛素的中間產(chǎn)物；
? 泛素活化酶E1將活化的泛素分子傳遞給泛素結(jié)合酶E2；形成一個(gè)E2-泛素的中間產(chǎn)物；
? 泛素連接酶E3先識(shí)別待降解的靶蛋白，再將結(jié)合E2的泛素連接到靶蛋白上，形成一個(gè)包含E2-泛素中間產(chǎn)物、E3 酶和靶蛋白的復(fù)合物；
? E2 酶和E3 酶，從上述的復(fù)合物中釋放，從而形成被泛素標(biāo)記的靶蛋白；
? 重復(fù)上述過程，直到蛋白質(zhì)上連接的多個(gè)泛素形成一條泛素鏈；
? 被泛素化的靶蛋白，被26S 蛋白酶體識(shí)別和降解。
泛素-蛋白酶體途徑[2]
泛素活化酶E1抑制劑
哺乳動(dòng)物中的泛素偶聯(lián)由兩種關(guān)鍵酶啟動(dòng)，即泛素活化酶UAE和UBA6，它們統(tǒng)稱為E1酶。UAE（由UBA1基因編碼）負(fù)責(zé)99%以上的細(xì)胞內(nèi)蛋白泛素化，而UBA6負(fù)責(zé)<1%的泛素化。經(jīng)典的E1酶均具有腺苷化結(jié)構(gòu)域(AD)、催化半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CCD)以及泛素折疊結(jié)構(gòu)域(UFD)。首先，在ATP和Mg2+存在下，E1酶催化Ub與ATP形成Ub-AMP加合物并結(jié)合到E1酶的AD結(jié)構(gòu)域，同時(shí)釋放是磷酸基團(tuán)PPi，CCD結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸巰基親核進(jìn)攻Ub-AMP鍵形成Ub-E1硫酯鍵并釋放AMP，另一個(gè)Ub非共價(jià)結(jié)合到AAD結(jié)構(gòu)域，形成攜帶兩個(gè)Ub分子的E1酶。然后，攜帶兩分子Ub的E1酶結(jié)合E2酶，通過UFD將Ub轉(zhuǎn)移到E2酶上，形成Ub-E2復(fù)合物，接著參與下一個(gè)Ub的活化。因此，抑制E1酶活性能夠阻斷泛素分子的活化，抑制泛素化過程，是潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)。
First-in-Class UBA1抑制劑TAK-243
TAK-243（MLN7243）是由Millennium研發(fā)的第一個(gè)進(jìn)入臨床的UBA1抑制劑，從超過700個(gè)化合物中篩選發(fā)現(xiàn)的，能夠與Ub形成Ub-TAK-243加合物，進(jìn)而結(jié)合到UBA1的ATP結(jié)合位點(diǎn)上，抑制UBA1活性。在多種癌細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)泛素介導(dǎo)的p53、c-Jun、c-Myc、XIAP等蛋白積累并表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，目前處于治療晚期惡性實(shí)體瘤的一期臨床。
TAK-243是一種首創(chuàng)的泛素活化酶 (UAE) 抑制劑。通過形成TAK-243-泛素加合物有效抑制UAE。用TAK-243在體外處理細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞泛素偶聯(lián)物丟失，導(dǎo)致泛素依賴性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和信號(hào)傳導(dǎo)缺陷，細(xì)胞周期進(jìn)程受損和DNA修復(fù)缺陷，蛋白毒性應(yīng)激增加，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。TAK-243在體內(nèi)治療腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞多泛素化急劇減少，并在攜帶人異種移植腫瘤的小鼠中誘導(dǎo)顯著的抗腫瘤活性。
TAK-243具有高選擇性，抑制UAE, UBA6, NAE和SAE的IC50值分別為 1, 7，28，850 nM。TAK-243-泛素加合物一旦形成，就會(huì)與UAE緊密結(jié)合并阻斷UAE的催化活性。TAK-243抑制UAE將泛素分子轉(zhuǎn)移到E2酶。
A: TAK-243 的化學(xué)結(jié)構(gòu) B: TAK-243-泛素加合物的結(jié)構(gòu)[3]
TAK-243體內(nèi)抗腫瘤活性研究
TAK-243的抗腫瘤活性分別通過使用
PDX 和 CDX
腫瘤模型進(jìn)行研究驗(yàn)證的。8至 12 周齡小鼠的側(cè)腹皮下接種腫瘤碎片或無血清培養(yǎng)基中的腫瘤細(xì)胞懸液?？蒲腥藛T使用 CDX 模型在小鼠中建立了皮下腫瘤：WSU-DLCL2 (彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤)、HCT-116（結(jié)腸癌）、THP-1（急性髓性白血?。?、CWR22（前列腺癌）、Calu-6 （非小細(xì)胞肺腺癌）、HCC-70（三陰性乳腺癌）和 MM1.S（多發(fā)性骨髓瘤），以及PDX 模型：PHTX-24c（結(jié)腸癌）、PHTX -132Lu（原發(fā)性NSCLC）、PHTX-55B（三陰性乳腺癌）、PHTX-235O（卵巢癌）和 HNM626（宮頸癌）。
在此項(xiàng)研究中，科研人員通過美迪西使用HCC-70模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在每只雌性裸鼠的腹部移植5.0×106 個(gè)HCC-70細(xì)胞形成HCC-70模型。當(dāng)平均腫瘤體積達(dá)到約 200 mm3時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分組，每組 8只動(dòng)物。在隨后的21天時(shí)間內(nèi)按每周兩次給藥TAK-243（12.5mg/kg) 和對(duì)照組 (20% HPβCD)。每周監(jiān)測(cè)兩次腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物體重。最后一次給藥后5天內(nèi)計(jì)算TGI。
TAK-243對(duì)HCC-70的生長(zhǎng)抑制曲線[3]
研究發(fā)現(xiàn) TAK-243 在所有檢查的模型中都誘導(dǎo)了顯著的抗腫瘤活性反應(yīng)。其中對(duì)CWR22、PHTX-235O、HCC-70和PHTX-55B的TGI達(dá)到90%以上。同時(shí)對(duì)動(dòng)物體重幾乎沒有影響。
TAK-243體內(nèi)抗不同腫瘤的活性[3]
總結(jié)與展望
泛素在調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和信號(hào)傳導(dǎo)中的不同作用突出了靶向 UPS 調(diào)節(jié)人類疾病的可能性。盡管有這種潛力，但在 UPS 中涉及的 500多種酶中，只有一小部分是已進(jìn)入臨床研究藥物可靶向的。蛋白酶體抑制劑Bortezomib的臨床成功引起了人們對(duì) UPS 的其他成分進(jìn)行研究的興趣和熱情。TAK-243是一種首創(chuàng)的、高效的UAE抑制劑，可完全抑制細(xì)胞泛素化，導(dǎo)致泛素依賴性蛋白水解受損、ER 應(yīng)激以及細(xì)胞周期進(jìn)程和 DNA 損傷修復(fù)受損。體內(nèi)外數(shù)據(jù)表明 TAK-243 通過UAE抑制發(fā)揮其作用。TAK-243的發(fā)現(xiàn)為研究蛋白質(zhì)泛素化提供了一個(gè)有價(jià)值的工具，并為研究蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和泛素信號(hào)傳導(dǎo)以用于腫瘤研究提供了新的機(jī)會(huì)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是多種疾病特別是腫瘤的重要靶點(diǎn)，靶向該系統(tǒng)會(huì)獲得更高的選擇性。
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美迪西藥理藥效服務(wù)
新藥研發(fā)的突破創(chuàng)新，離不開各種科技平臺(tái)的強(qiáng)大支持。近年來，藥理藥效評(píng)價(jià)、動(dòng)物模型和基因&細(xì)胞療法等技術(shù)不斷迭代更新，飛速發(fā)展，動(dòng)物模型已在新藥研發(fā)進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。不同
疾病動(dòng)物模型的建立為研究疾病發(fā)生與發(fā)展機(jī)制、篩選和評(píng)價(jià)抗疾病藥物提供了有力的工具。美迪西擁有約30000平方米實(shí)驗(yàn)室，通過AAALAC認(rèn)證，加上充足的動(dòng)物供應(yīng)，可以執(zhí)行小鼠、大鼠、兔、豬、狗、猴等動(dòng)物的動(dòng)物模型構(gòu)建。
美迪西藥理藥效部緊跟行業(yè)發(fā)展與市場(chǎng)需求，不斷完善創(chuàng)新，經(jīng)過多年的經(jīng)驗(yàn)累積，多方驗(yàn)證和長(zhǎng)期實(shí)踐考驗(yàn)，建立了完善的動(dòng)物模型庫(kù)，可根據(jù)客戶的需求提供各種有效的動(dòng)物模型，用來檢測(cè)藥物的有效性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、犬、大小鼠、兔、豚鼠、小型豬等種類。
? 已建立將近300種腫瘤評(píng)價(jià)模型，同時(shí)我們?yōu)閯?chuàng)新療法賦能，全面布局腫瘤免疫療法的評(píng)價(jià)和研究，已完成CAR-T，TCR-T, CAR-NK, 溶瘤病毒, 抗體（單抗，雙抗，多抗等），siRNA, AAV等免疫療法的模型建立及藥效評(píng)價(jià)。
? 根據(jù)客戶的需求提供各種有效的動(dòng)物模型（腎衰模型、貧血?jiǎng)游锬Ｐ?、胃酸分泌?dòng)物模型、胃潰瘍模型等），用來檢測(cè)藥物的有效性。常規(guī)的消化系統(tǒng)疾病有：胃酸分泌、胃潰瘍、腎衰等，通過大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
? 在代謝性疾病領(lǐng)域具有數(shù)十個(gè)穩(wěn)定有效的動(dòng)物模型，尤其對(duì)于臨床缺乏有效藥物治療、且近期研發(fā)火熱的NAFLD疾病領(lǐng)域具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和有效的動(dòng)物模型。
? 為炎癥免疫疾病藥物的藥效評(píng)價(jià)提供了多種針對(duì)不同靶點(diǎn)及通路，穩(wěn)定可靠，擁有良好評(píng)價(jià)能力的動(dòng)物藥效評(píng)價(jià)模型，為新藥的臨床轉(zhuǎn)化提供助力。
? 建立了涵蓋抗抑郁藥、抗老年癡呆癥藥、鎮(zhèn)靜催眠抗焦慮藥、鎮(zhèn)痛藥、抗驚厥藥、抗帕金森氏癥藥以及抗精神分裂癥藥等眾多疾病精神系統(tǒng)疾病模型評(píng)價(jià)技術(shù)，可以從分子水平、細(xì)胞水平、Ex-vivo、invivo等多層面全面評(píng)價(jià)一類創(chuàng)新藥物。
? 根據(jù)客戶的需求提供各種有效的動(dòng)物模型，常規(guī)的動(dòng)物模型有：全層皮膚創(chuàng)傷疾病動(dòng)物模型、壓瘡潰瘍疾病動(dòng)物模型、自發(fā)性高血壓大鼠疾病動(dòng)物模型等，通過大小鼠、SHR大鼠等進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
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