近日，FDA更新了《人用藥物中亞硝胺雜質控制》指南的新版本，為生物醫藥行業對于亞硝胺雜質研究提供了更明確的指導。隨著全球監管機構針對亞硝胺雜質的監管力度持續加強，研發人員需要更加藥物安全的風險評估，并從源頭上控制其產生。亞硝胺雜質的產生與合成工藝路線密切相關，美迪西云講堂攜手經驗豐富的肜祺老師，和您一起解決探索亞硝胺雜質分析的常見問題。

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1 LC-MS儀器分析方法靈敏度是不是很能難達到要求，不能用于亞硝胺基因毒性雜質方法開發？

肜祺：根據實際情況，亞硝胺雜質的檢測限度通常非常低，一般在ppm或ppb級別，對于LC-MS來說，這樣的靈敏度要求可能超出了它的能力范圍。這時可以選擇MS-MS聯用或高分辨質譜技術來進行研究。

在某些情況下，如果API的日攝入量很低，且亞硝胺雜質的限度能夠控制在100 ppm以上ppm水平，LC-MS也有可能被用來檢測亞硝胺雜質。

2 如果沒有亞硝胺標品的情況下如何進行研究？

肜祺： 在LC-MS或GC-MS方法開發過程中，針對不同亞硝胺化合物，其吸收和響應特性是存在差異的。因此，為了確保分析的準確性和重現性，開發專屬的檢測方法是非常必要的。這通常需要亞硝胺的標準品來進行方法的建立和驗證。

然而，在研究過程中，如果亞硝胺的標準品難以獲得，或者通過多種嘗試仍無法得到穩定的標準品，這可能從側面反映出在正常條件下，API中亞硝酸類雜質的存在概率較低。在這種情況下，可以在資料中進行詳細的描述和論證，說明由于亞硝胺標準品難以獲得，從而推斷其產生的風險較低。在這個情況下，可以不必進行深入的方法開發。

3 IND階段就要完成亞硝胺雜質研究嗎？

肜祺：在IND階段，對于基毒雜質的研究，尤其是亞硝胺這類突變雜質，現在大家的要求越來越嚴格和完善。對于非癌癥治療藥物，評審老師通常會要求在IND階段就開始對突變雜質進行初步研究。亞硝胺雜質由于其潛在的致癌風險，屬于ICH M7(R2)指南中提到的“關注隊列”物質。因此，在IND階段進行初步評估是非常必要的。
后續在NDA階段，由于工藝可能會有所調整，因此IND階段對于突變雜質的評估可能不需要過于深入，進行初步的評估和控制就可以。

4 亞硝胺雜質方法開發有沒有推薦的色譜柱?

肜祺：根據一般項目情況，我們通常使用標準的十八碳色譜柱來檢測亞硝胺等化合物，這些色譜柱能夠高效地分離并檢測目標化合物。也需要根據具體項目的化合物的特性和分離需求，選擇最合適的色譜柱，確保分析結果的準確性和可靠性。

5 如果多批樣品中檢測出10%限度以上的亞硝胺雜質，質量標準中亞硝胺限度是否可以按計算出的單個亞硝胺限度進行制訂？

肜祺：若僅有1個亞硝胺雜質檢出為10%限度以上，則可按計算出的單個亞硝胺限度設定質量標準；若多個亞硝胺雜質均為10%為了不超過ICH M7(R2)指南中概述的1:10萬的可接受風險水平，有兩種方法被認為是可接受的:
1. 所有確定的n -亞硝胺的每日總攝入量不超過確定的最敏感的n -亞硝胺的限度；
2. 所有確定的n -亞硝胺計算的總風險水平不超過十萬分之一；
2.1 固定方法：對單個亞硝胺設定固定的限度，不需要對總n -亞硝胺設定限制。每種n-亞硝胺的限量應按其限度的百分比設定，使每種指定亞硝胺的限度百分比總和不超過100%；
2.2 靈活方法：每種n-亞硝胺按計算出的限度設定標準，并要求對總n-亞硝胺規定額外的限量為每種指定亞硝胺的限度百分比總和不超過100%。詳見EMA亞硝胺問答Q10。

6 使用EP或USP的原檢測方法，方法是否可以不用驗證？

肜祺：使用EP、USP的原檢測方法，需要進行方法確認，確認檢測實驗室可滿足靈敏度、線性、準確度等的需求，以確保檢測結果的可靠性。

7 什么情況下需要做加強AMES試驗？

肜祺：若不能在權威機構數據庫中檢索到已識別出的n-亞硝胺雜質的毒理數據，可用加強AMES試驗、體內致突變試驗等確證該n-亞硝胺雜質的活性；尤其是在樣品中該亞硝胺雜質檢出量超出根據常規方式（如致癌效力）計算出的限度時可以進行。
但是對于亞硝胺雜質檢出量超出根據常規方式計算出的限度時，首先需要確認其來源，盡量從源頭進行去除，采取避免為主，控制為輔的控制策略。

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