開篇引言

世界著名作家、大思想家斯賓塞·約翰遜曾經說過“唯一不變的是變化本身”，而在藥物研發過程中，藥物活性成分的合成往往伴隨著雜質的生成，任何物質的純凈程度只能無限接近100%，在人類認知的范圍內目前還不存在100%純凈的物質，換句話說“認知中可以存在的純凈物質那只有不純物了”。

1 藥物雜質與基因毒性雜質介紹

關于雜質，異于活性成分的物質我們將其統稱為雜質，這些成分通常是無效的、與活性成分使用目的無關或者是有其他毒副作用的物質。而藥物的質量研究過程就是通過目前人類所掌握的分析手段，對異于活性成分的物質進行定性和定量研究，并基于ICH、藥典等相關指導原則并結合文獻數據等手段對這些雜質進行安全限度的制定和評估，藥物研發中的雜質可分為有機雜質（與工藝和藥物結構有關的）、無機雜質和殘留溶劑等。

雜質的存在通常會帶來潛在的安全性風險，對患者來說有害而無益，其中高毒高活性雜質、基因毒性（致突變、致癌性等）雜質更是藥物研發過程中的控制重點，其研究思路通常為雜質的定性、雜質的制備、結構確證與表征、限度制定、控制方式制定、高靈敏度的分析方法開發與驗證等。

對于藥物的研制原則，通常遵循ICH相關指導文件的研究思路，即人用藥品注冊技術國際協調會議（The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; ICH）。

ICH是由歐盟、美國、日本三方成員國于1990年共同發起，對三方成員國家的人用藥品注冊技術要求的現存差異進行協調的國際組織。1994年3月15日，ICH Q3由指導委員會同意進入第二階段，公開意見征求，藥物研發過程中的雜質研究進入到了人們的系統關注中，從1995年3月30日開始，ICH相繼發布Q3A（新原料藥中的雜質）、Q3B（新制劑中的雜質）、Q3C（雜質：殘留溶劑指南）、Q3D（元素雜質指導原則），建立了ICH成員國和遵循ICH原則國家的統一雜質研究標準，具體的提出了雜質控制策略和限度要求等內容^[1]。

隨著科技的進步和分析手段的完善以及人們對學科的認識和對化合物的深入研究，發現某些雜質在極低的濃度下即可誘導基因突變并導致染色體的斷裂和重排，具有潛在的致癌性，這類雜質人們將其定義為致突變雜質。Q3A和Q3B僅能為大多數雜質的定性和控制提供指導，對DNA反應性雜質的指導很有限，2013年2月6日，ICH M7（基因毒性雜質）獲得執行委員會批準，并且發布供公眾參考，為醫藥研發生產提供了一個用于致突變雜質的鑒別、分類、定性和控制的可行性框架方案，用于控制雜質潛在的致癌性風險。至此，ICH針對藥物中雜質研究的框架已基本搭建完成。

根據致突變潛力和致癌性對雜質進行分類，通常以數據庫和文獻的檢索獲得的雜質致癌性和細菌致突變數據對實際和潛在雜質進行初步分析，危害性評估將其歸類為1類、2類或5類。若無法獲得這些數據，則應進行預測細菌致突變性的構-效關系（SAR）評估。根據評估結果將其分為3類、4類或5類^[2]。

上表中多次提到了警示結構，警示結構是化合物結構與生物活性的關系的研究總結的一系列結構，主要是結構與毒理學毒性的關系，需要注意的一點是，有警示結構的化合物不一定具有遺傳毒性，有遺傳毒性的化合物通常具有警示結構。

目前，一般將致癌物分成兩大類：

一類是遺傳毒性致癌物（geno-toxic carcinogens），通過化學鍵合直接破壞遺傳物質產生致癌性，大多數的化學致癌物具有遺傳毒性；

第二類是非遺傳毒性致癌物（epicarcinogens，或稱為外遺傳性致癌物），通常不與DNA發生化學鍵合作用，不對DNA產生直接破壞，而是通過遺傳物質外的間接機制引起致癌作用（如促進細胞過度增殖等），這類致癌物在致突變試驗（如Ames試驗）中一般呈陰性結果。

盡管非遺傳毒性致癌物的致癌作用機制各不相同，但遺傳毒性致癌物的作用機制卻表現出較高的一致性，這類物質具有DNA反應活性，通過與遺傳物質發生化學鍵合引起遺傳信息的改變并產生致癌性，基因突變往往是此類物質產生致癌性的起始步驟。遺傳毒性雜質的警示結構通常是指雜質結構中的某些特殊基團或結構分子。這些特殊的結構單元具有與遺傳物質發生化學反應的能力傾向，一旦遺傳物質發生改變則通常會誘導基因突變或者導致染色體重排或斷裂，因此具有潛在的致癌/致突變風險。Ashby等總結提出了18種警示結構的模型，根據這18中警示結構整合成的“超級致癌物”虛擬化合物分子。

超級致癌物的虛擬結構

致突變雜質的安全閾值較一般雜質低很多，很低含量的情況下便可可能會引發致突變或致癌，因此對其控制要求更加嚴格，對工藝要求和對分析檢測能力的要求也非常高。警示結構對于雜質的遺傳毒性和致癌性具有提示作用，對于警示結構的早期識別和規避有助于提高藥物研發的效率、降低生產和控制成本。正如上文所說，致癌性雜質可分為遺傳毒性和非遺傳毒性，在結構上可分為遺傳毒性致癌性警示結構和非遺傳毒性致癌性警示結構^[3]，如下表：

就像上文中所提到的，含有警示結構的化合物不一定具有遺傳毒性，而有遺傳毒性的化合物也不一定會產生致癌性。遺傳毒性雜質的限度計算通常包含TD₅₀、TTC法等，篇幅有限這里不做更多的說明。

化合物是否具有遺傳毒性，單單從是否含有警示結構上判斷是不夠科學也不夠嚴謹的，還需結合化合物相關毒理學文獻檢索，雜質化合物軟件評估預測以及Ames試驗等進行判斷，基于大量理論研究和實踐經驗總結出的警示結構，對于雜質的潛在致癌性有一定提示作用。因此在進行雜質安全性評估和控制策略選擇時，對于缺少遺傳毒性數據的雜質，警示結構作為區分普通雜質和“高活性”雜質的標志可以提高篩選效率、減少毒理學評價的工作量。但是應當指出，警示結構的存在與否并不能明確給出該雜質是否具有遺傳毒性和致癌性的結論。對于缺少遺傳毒性數據的雜質，警示結構可以作為辨識遺傳毒性和致癌性雜質的起點，之后才會考慮啟動構-效關系預測和體內外安全性研究，以進一步確認該雜質是否具有遺傳毒性和致癌性。

2 美迪西設備技術和服務

美迪西是一家專業的生物醫藥臨床前綜合研發服務 CRO，其中藥學研究板塊CMC包括原料藥研究、質量標準建立、穩定性研究和申報服務。在致突變雜質研究的方向，美迪西具有專業的雜質評估團隊，可支持毒性試驗研究、Ames試驗，同時引入了專業結構評估軟件 Case Ultra，軟件同時包含基于統計學的和基于專家規則的模型，兩個模型組合可以完整的滿足ICHM7 要求。對于致突變雜質的研究，美迪西有專業經驗豐富的雜質定性定量研究團隊和國內先進的儀器設備,儀器包括 Bruker 400M HMR、Agilent 5977A GC-MS、Agilent 7000D GC-MSMS、Agilent/SHIMADZU/Thermo Fisher LC-MS、Agilent 6470 LC-MSMS、Thermo Fisher Q Exactive Plus HRMS 等。

3 美迪西案例分享

某原料藥在合成制備工藝中，根據評估分析可能因試劑和工藝過程引入苯、烯丙基溴、烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷，根據ICH Q3C殘留溶劑部分，苯歸屬于1類溶劑，屬高毒高活性雜質，期限度為2ppm；烯丙基溴、烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷，根據結構判斷其屬于鹵代烷烴類化合物，含有鹵代烷烴警示結構，使用Case Ultra基于統計學的和基于專家規則的模型評估，軟件模擬結果烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷雜質分類為1類，烯丙基溴雜質分類為2類。

查閱相關文獻并結合原料藥的最大使用劑量，從嚴控制雜質限度，最終確定苯的限度2ppm、烯丙基溴38ppm、烯丙基氯35ppm、1-溴-3-氯丙烷30ppm。

采用GC-MS定量檢測，在Scan模式下確定各組分化合物的定性離子和定量離子。70eV條件，Scan模式下總離子流質譜信息如下：

在排除各組分化合物互相干擾的離子情況下，確定各組分的定性和定量離子，苯的定性離子m/z 51和m/z 77，定量離子m/z 78；烯丙基溴m/z 81和m/z 122，定量離子m/z 120；烯丙基氯m/z 75和m/z 78，定量離子m/z 76；1-溴-3-氯丙烷m/z 79和m/z 156，定量離子m/z 158。

定量模式SIM模式下，各組分化合物滿足ppb級別極低的靈敏度要求。

[1] ICH Q3A(R2) 新原料藥中的雜質

[2] ICH M7(R2) 遺傳毒性雜質

[3] 馬磊,馬玉楠,陳震等.遺傳毒性雜質的警示結構[j].中國新藥雜志,2014,23(18):2106 2111)

CMC系列(一)淺談藥物研發中原料藥工藝研究的重要性

CMC系列(二)藥學研究之世界銀屑病日

CMC系列(三)高端吸入藥物的市場格局和研究現狀

CMC系列(四)淺談手性藥物的研究策略

CMC系列(五)藥物晶型控制策略

CMC系列(六)含氮類化合物-可揮發堿性有機胺的氣相分析

CMC系列(七)新藥研究中的固態開發挑戰及應對策略

CMC系列(八)淺析ICH指導原則Q3C及未收錄殘留溶劑限度制定方法

CMC系列(九)定量核磁應用及其方法驗證/定量核磁那些事兒