高效液相制備純化技術是一種在生物醫藥行業中非常關鍵的純化技術，利用不同的化學性質來分離混合物中的各種組分。在醫藥研發領域，完整的雜質研究和充分的雜質控制，直接關系到藥品的安全性和有效性，是藥物成功獲批的重要因素之一。

然而，雜質研究的難點在于識別和控制那些在生產過程中或穩定性研究中產生的未知且頑固的雜質。這些雜質的生成機制復雜，結構未知，難以通過常規方法進行追蹤和分析。在這一挑戰面前，制備液相技術成為解決難題的利器。作為一種高效的分離技術，HPLC能夠從復雜的樣品中分離出微量的雜質，為進一步的結構鑒定和毒性評估提供了可能。這不僅解決了雜質研究中的關鍵難題，也為藥品的安全性和有效性提供了更為堅實的保障。

美迪西云講堂邀請工藝分析部李墨，為您深入解析HPLC操作的關鍵注意事項，并提供解決常見操作難題的策略和方法。

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01 剛提到的降低柱溫用來增加化合物保留，但是我遇到過升高柱溫化合物保留也增加的情況，這是什么原因呢？

李墨：在色譜分析中，通常降低柱溫，溶質的保留時間會增加。在少數情況下，我們化合物的保留時間會隨著溫度增加而增加，原因可能是溶質分子產生了離子化，或者跟溶質分子的結構有關系，或者固定相可能會隨著溫度改變，都可能導致保留時間的增加。

02 制備樣品的溶解性要怎么試？有什么好的建議呢？

李墨：首先拿到樣品之后，建議是先咨詢合成部門同事，詢問化合物是從什么溶劑中旋蒸出來的，了解化合物的原始溶劑。或者進行嘗試，可以稱取幾個約10毫克的樣品于進樣小瓶中，準備進行溶解性測試。向每個樣品中加入100微升的稀釋劑，觀察其溶解性。如果樣品不溶，可以逐步增加稀釋劑量。如果觀察到樣品在中性條件下不溶，可以考慮加入少量的酸或堿以幫助溶解。常用的溶劑一般可以考慮使用甲醇乙腈，如果這些溶劑無法溶解樣品，可以嘗試更通用的溶劑，如二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）或N-甲基吡咯烷酮（NMP）。這些試溶解性的樣品后續可以用來進行方法開發，也不浪費樣品。

03 什么是預飽和？目的是什么？

李墨：預飽和技術在色譜分析中扮演著重要的角色，其主要目的是保護色譜柱，并維持其性能的穩定性。預飽和可以防止色譜柱內的固定液流失，在流動相進入色譜系統之前，預飽和柱會對流動相進行處理，使其與固定液充分接觸，達到飽和狀態。飽和之后再進入分析柱當中，就會防止分析柱中的固定液流失，從而保持我們色譜柱的性能不變。

04 保護柱不能超聲應該怎么清洗？

李墨：直播提到保護柱不能夠劇烈超聲，是因為可能會對填料產生一定損傷，如果保護柱出現污染，可以將其擰開并拆開，取出柱芯，使用50%異丙醇溶液進行清洗，以去除表面吸附的樣品。發生一些強污染的時候，可以像常規的色譜柱一樣進行單獨的沖洗，把污染物沖出來。要注意定期檢查保護柱的理論塔板數，以評估柱效是否下降。同時注意壓力是否異常上升，這些可能是更換保護柱的信號。由于保護柱屬于耗材，當性能下降時，只需更換柱芯，無需更換整個色譜柱，這樣可以節省成本并保持分析的連續性。

05 結構類似物實戰中用哪些柱子分離呢？

李墨：選擇哪種色譜柱取決于待分離分子的化學性質、大小、極性以及所需的分辨率和選擇性。比如對于苯環類化合物，特別是鹵代苯（如氯苯、溴苯等），使用苯基柱可以提高分離效果，對于苯環上的取代基團位置不同，也可以考慮使用五氟苯基柱等等。

06 怎么解決峰型異常的問題？比如分叉峰之類

李墨：在色譜分析過程中，我們可能會遇到一些常見的問題，如樣品過載、溶劑使用不當、色譜柱污染或失效等。這些問題都可能會導致峰型異常，影響分析結果的準確性。解決辦法可以考慮使用降低樣品的載樣量，比如降低它的濃度，或者減少樣品的進樣體積，或者更換樣品溶劑等等，如果色譜柱出現污染或效能降低，更換新的色譜柱可以恢復分析的準確性和重復性。

07 李墨老師特別分享：保留因子K的公式推導過程
保留因子k：用固定相中的溶質分子總量，除以流動相中的溶質分子總量來得到。流動相和固定相中的分子量等于樣品的濃度(Cs和Cm表示)乘以相的體積(Vs和Vm表示),因此可以引導出等式
k=(CsVs)/(CmVm)=( Cs/Cm)/( Vs/Vm)
=KΨ（k是平衡常數，Ψ是流動相和固定相的比值）
溶質分子肯定會出現在固定相或者流動相里,假設流動相里的溶質分子分數為R，在固定相的溶質分子分數就應該是1-R，因此就可以得到
k=(1-R)/R    
或者
R=1/(1+k)   
溶質分子X的保留時間可以定義為距離除以速度，這里的距離就是色譜柱的長度L，色譜帶的速度是ux:
tR=L/ux
同樣地,溶劑峰的保留時間就是
t0=L/u
式中,u是流動相的平均速度。把等式的L去除之后就衍生出下面這個等式
tR=t0u/ux
溶質分子X 通過色譜柱時的移動速率或者速度ux，可以通過計算在任何時間里出現在流動相內的該分子的分數R 來得出。一般來講，ux應該等于R 乘以移動的速率或者溶劑分子的流動速度U:
ux=Ru0
所以用ux=Ru和R=1/(1+k)進行取代tR=t0u/ux,就得到下面的等式
k=(tR/t0)-1
式中tR 為化合物保留時間，t0為死體積時間

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