高通量篩選服務

高通量篩選技術簡介

• 高通量篩選(HTS)是藥物發現中的一個關鍵技術，用于從化合物庫中識別可能成為藥物化學優化的候選化合物。該技術體系應用了藥理學技術、分子生物學技術、細胞生物學技術、計算機技術、管理技術以及自動化控制技術等，實現了藥物篩選的快速、高效、微量化、自動化和規模化。

  隨著高通量篩選技術的發展，可以更加快速高效地篩選大量化合物，從而加快藥物發現的速度。美迪西生物學和藥理學部提供高通量篩選服務，我們擁有強大的級聯篩選小分子抑制劑、體外的酶活性和細胞活性檢測開發能力。

  美迪西的高通量篩選服務可以做：級聯篩選小分子抑制劑；體外酶活性測定；體外細胞活性測定；高通量篩選分析等。

  藥物發現中的高通量篩選過程涉及篩選大型化合物庫，以找到影響生物靶點的潛在候選化合物。這些候選化合物通常被稱為“苗頭化合物”^[1]。美迪西生物部擁有超過 3000 種化合物的庫，化合物篩選能力可以是 200x384 孔板/周，也可以根據客戶的需求進行定制。同時我們與 Selleck、MCE、Tocris和TargetMol 等提供化合物庫的合作伙伴密切合作。

  高通量篩選過程可以通過各種方法來實現，包括讀板器以及相應的軟件來處理和分析所獲得的數據。一旦發現這些潛在的“苗頭化合物”，對高通量篩選數據的進一步分析還可以提供有關第一輪篩選期間獲得的這些“hits”的潛在優化的信息^[1]。

級聯篩選—小分子化合物抑制劑

• 級聯篩選是藥物發現過程中識別和選擇先導化合物系列的一套測定方法，作為一種多層次的生物化學或藥物研究方法，通常用于篩選藥物或化合物庫以尋找潛在的藥物先導化合物。這種方法涉及多個生物學活性的級別，以便篩選潛在的藥物目標。在這個過程中，可能會發現一些具有潛力的"先導化合物"，這些化合物可以進一步開發成為新藥物。

  

  開發小分子抑制劑需要強大的級聯篩選，來有效地識別與靶蛋白結合的化合物，確定對不需要的相關蛋白的選擇性，并在下游功能測定中證明活性。

  靶標驗證、分析開發、二次篩選、ADME/Tox 和先導化合物優化等領域越來越多地使用 HTS 技術。

體外酶活性檢測

• 酶活性的變化可以快速調節機體的生理功能或病理過程，激酶、蛋白酶和肽酶是最常見的藥物靶點。利用酶活性分析技術可以快速、高效地評估化合物對目標酶的抑制能力，從而篩選出具有潛力的候選化合物。

  

  酶活性檢測的方法包括酶反應的底物、產物等，反應大多在均相的環境下進行。底物還原測量（ATP、NAD/NADP、SAM、乙酰輔酶A、肽、DNA、RNA 等）- Down 測定產品測量 - Up 測定

• 酶活性檢測- 案例 1

  HTRF 測定-均相時間分辨熒光

  
  Donor=Eu and Tb
  Acceptor=XL665
  優點：（1）特異性強，信號本底比（signal/background ratio）高；（2）熒光信號高度穩定；（3）反應均相，通量高。缺點：（1）特異性抗體成本較高； （2）針對特定靶點需要開發特異性抗體。

• 酶活性檢測- 案例 2

  ADP-Glo 檢測

  
  優點：(1) 靈敏度高；(2) 可以檢測激酶以外的酶。

• 酶活性檢測- 案例 3

  Z’-Lyte 檢測

  
  優點：(1)高信號本底比，高通量；(2)成本低。缺點：(1)無法檢測反應機制復雜的酶；(2)難以評價本身有很強的自發熒光的化合物；(3)檢測蛋白酶時會出現假陽性數據。

• 酶分析方法開發- 關鍵因素

  酶分析方法優化和驗證常采用酶滴定法、時間進程分析、米式常數測定、DMSO耐受性、Z-prime 測試和化合物驗證等。
  

  酶滴定和時間進程分析注：窗口（信號本底比）>3。

  

  ATP Km 和底物 Km注：選擇接近Km值的底物濃度
  

  DMSO耐受性：測試測定中可以耐受的最大DMSO濃度。注：DMSO 通常小于 1%

  

  Z’：代表板的均勻性。σ=SD，μ=mean注：Z’>0.5 將作為酶法檢測的 QC 標準
  

  化合物驗證：使用參考化合物來檢測測試的重現性注：IC50應為已發布值的5倍

  Plate layout：

  

  IC50 報告標準最大抑制百分比應大于 50%。最高值和最低值應在理論值的 15% 以內IC50 的 95% 置信限應在 2-5 倍范圍內。

體外細胞活性檢測

• 細胞活性篩選是新藥篩選中的常用方法，在細胞層面上評估化合物的活性和毒性，能夠很好地模擬藥物在體內的作用情況。基于細胞的檢測已在制藥行業的藥物篩選中占據了一定的地位。這些測定能夠通過功能表征潛在藥物靶標在細胞中的作用以及評估藥物先導化合物的特異性和功效來評估潛在藥物靶標^[2]。美迪西的體外細胞檢測服務包括：
  表型測定：細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、壞死性凋亡、自噬等。 功能測定：下游信號如蛋白磷酸化、第二信使（Ca²⁺、cAMP、IP3、cGMP）。細胞中的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）：NanoBiT,NanoBRET,BiFC。
  

  表型測定

  

  第二信使-Ca²⁺

  

  蛋白與蛋白相互作用

• 細胞檢測開發 - 細胞毒性測試

  僅使用高通量篩選不能完全評估潛在藥物，因為此評估還需要進一步進行毒性研究。相反，高通量篩選對于消除在研究對生物靶標影響很小或沒有預期影響的化合物上浪費的時間至關重要。通過利用這種自動篩選過程，可以一起篩選數百萬種化合物，并消除沒有效果或效果差的化合物^[1]。
  細胞毒性測試需要從細胞接種密度、培養時間、DMSO耐受性、Z-prime test、edge effect、化合物驗證幾個方面來考慮。

  1. 細胞接種密度

  細胞活力>80%不同細胞密度的板中的種子細胞培養72~96小時，CTG/CCK8檢測細胞活力在線性范圍內選擇 CTG/CCK8 信號的密度窗口（信號本底比）>2

  2. 培養時間

  選擇優化的密度和種子細胞在不同時間點孵育細胞/化合物使用 CTG/CCK8 檢測細胞活力具有最佳檢測窗口和數據質量的時間點將用于進一步的實驗窗口（信號本底比）>2
  

  3. DMSO耐受性

  不同劑量的DMSO與細胞孵育72至96小時，CTG法檢測細胞活力注意：細胞檢測中 DMSO 的含量通常低于 0.5%

  4&5. Z-prime test and edge effect

  QC標準：Z’>0.4，窗口>2通常邊緣孔不會用于長期培養

  
  

  6. 化合物驗證

  陽性化合物應為參考數據的 5 倍

  Plate layout：

  

  

高通量篩選分析

• 高通量篩選分析流程圖

  高通量篩選依靠自動化來快速測試大量化合物，高通量篩選中生成的大量數據需要強大的數據處理和分析工具。專門的軟件和算法可以用于處理、分析和可視化結果，使研究人員能夠識別潛在的“苗頭化合物”或表現出所需活性的化合物。
  1. 測定優化（Z’、測定窗口、DMSO 耐受性、參考化合物測試）2. 將首先對數千種化合物進行試點研究以測試該測定法3.還將建立正交測定法以消除假陽性化合物4. 對數以萬計的化合物運行 HTS5. 命中率通常會設置為0.1%到0.5%
  高通量篩選加速了藥物發現過程，使其更具成本效益和效率，使研究人員能夠快速篩選多種化合物，從而減少識別潛在候選藥物所需的時間。HTS 通常是一個迭代過程，包含多輪篩選、命中驗證和先導化合物優化。研究人員根據早期篩選的結果和經驗來完善他們的化合物庫和測定方法。

• 高通量篩選-案例

  PSMA:

  前列腺特異性膜抗原（PSMA）是治療晚期前列腺癌（PC）和各種實體瘤的有希望的靶標。盡管 PSMA 靶向放射性藥物治療 (RPT) 已實現顯著的成像和前列腺特異性抗原 (PSA) 反應，但積累的臨床數據開始揭示某些局限性，包括無反應者亞組、復發、放射誘導毒性和 需要專門的管理設施。迄今為止，利用 PSMA 通過抗體、納米藥物或細胞療法治療 PC 的非放射性嘗試已取得一定成功。 我們開發了高通量 PSMA 酶測定法來鑒定新的 PSMA 調節劑。
  

  底物滴定

  

  參考化合物測試

  Z 因子測試和分析窗口測試

  

  
  使用384孔板進行測定驗證，四塊板的數據顯示Z因子高于0.5，測定窗口高于10倍。

  苗頭化合物識別

  

  
  總共使用100 x 384孔板篩選了30,000多種化合物，并在10天內完成，當將PSMA活性抑制設定為50%時，命中率約為0.8%。

總結

• 美迪西擁有強大的化合物檢測開發和化合物篩選能力。我們的篩選能力可以是 200x 384 孔/周，或根據客戶的需求進行定制。樣品是高通量藥物篩選的物質基礎，樣品庫來源的化學多樣性是決定高通量篩選技術能否成功的關鍵因素之一。我們與 Selleck、MCE 和 Tocris 等提供化合物庫的合作伙伴密切合作，內部擁有超過 3000 種化合物的庫。

附錄

• 來自 MCE（第三方供應商）的化合物庫

  化合物庫名稱	規格和貨號	描述
  50K 多樣性庫	50K  HY-L901	該庫中的化合物通過相異性搜索（谷本相似性系數為 0.52）進行選擇，以提供更高的多樣性和更廣泛的化學空間覆蓋范圍。
  UORSY篩選庫	680K  HY-L0103V	UORSY 篩選化合物庫包含約 680,000 種化合物。 該文庫是通過聚合合成方法構建的，提供了高度多樣化的化學結構。 庫中超過85%的化合物具有類藥的理化性質，超過35%的化合物具有“lead-like”的性質。
  生物活性化合物庫 Plus	20K  HY-L001P	? 生物活性和安全性經臨床前研究和臨床試驗證實。有些已獲得 FDA 批準。 ? 廣泛應用于癌癥、干細胞、神經信號、免疫等研究重點領域。
  多肽庫	1.1K  HY-L105	? 包括生物活性肽、氨基酸衍生物和封閉肽。 ? 多肽藥物發現和疫苗開發的有用工具。
  1,000萬虛擬類藥多樣庫	10M  HY-L912V	MCE 的 40,662 個 BB，涵蓋約 273 種反應類型，生成了超過 4000 萬個分子。選擇符合 Ro5 標準的化合物。移除掉不適當的化學結構，例如 PAINS 基序和合成上難以獲得的結構。 基于摩根指紋圖譜進行分子聚類分析，提取靠近每個聚類中心的分子，形成類藥物且可合成的多樣性庫。 這些選定的分子擁有 805,822 個獨特的 Bemis-Murcko 支架 (BMS)，具有多樣化的化學空間。 強烈推薦該庫用于基于人工智能的先導化合物發現、超大規模虛擬篩選和新的先導化合物的發現。
  膜受體靶向化合物庫	4.2K  HY-L150	? 4333種膜受體靶向化合物獨特集合。 ? FGFR、TRP 通道、VEGFR、TNF 受體、阿片受體、5-HT 受體、離子通道等靶點。
  片段化合物庫	22K  HY-L032	? 獨特的21965 個片段化合物集合，用于通過高通量篩選(HTS) 進行傳統先導化合物鑒定。 ? 基于片段的藥物發現方法(FBDD) 的有用工具。
  中藥單體化合物庫	2.7K   HY-L065	? 獨特的2712 種中藥活性化合物集合，用于高通量篩選(HTS) 和高內涵篩選(HCS)。 ? 庫中的化合物包含糖類和糖苷、苯丙素、醌類、黃酮類、萜類和糖苷、類固醇、生物堿、酚類、酸類和醛類。

  這些庫可在 MCE（MedChemExpress，第三方供應商）中找到， 我們可以與 MCE 合作使用它們。 我們擁有的一個是中藥單體化合物庫。

• 來自 Targetmol（第三方供應商）的化合物庫

  名稱	規格及貨號	簡介
  2600萬虛擬篩選庫	26M	由Targetmol整理的開源數據庫，收錄了全球主要的篩選化合物產品數據，包含千萬級的化合物結構，致力于為全球科研人員提供一個穩定可靠的數據庫。
  100K多樣性預制化合物庫	100K & DS7000	基于160萬篩選化合物和130億類藥和類先導化合物的虛擬空間精心挑選而出，旨在提供新穎的化學結構。
  多樣性核心預制庫	50K & LF1000	精心挑選50000種具有優良理化特性的類藥分子，以較小的化合物數量實現結構多樣性的篩選目的。這些化合物基于新合成的化合物集合，使用結構差異性方法篩選而出。
  EXP多樣性庫	50K & CB1100	基于50萬類先導和類藥化合物集合精心挑選而出，旨在提供多樣的化學結構，并呈現出良好的類藥和類先導特性，適用于多種研究目的使用
  藥物靶點庫	53K & DO1200	基于“靶點多樣性”概念和現有數據，通過計算機虛擬篩選、結構生物學、體外、細胞和表型預測等多種工具，對Chemdiv 160萬個化合物進行篩選，得到5.3萬個類藥分子，涵蓋200多個藥物靶點。
  多樣性核心庫Part1	50K & DF4500	精選5萬種化合物，覆蓋160萬種化合物的結構空間。該庫在剔除PAINS、經過REOS和MedChem過濾器后，專注優化化合物結構的多樣性。
  代表性核心庫（基于Bemis-Murcko Clustering算法）	300K & DD3700	基于Bemis-Murcko-clustering理論生成BMS骨架，經聚類分析、類藥性質分析，獲得的多樣性庫。
  DGK抑制劑庫	12K & L9920	收集880余種DGK抑制劑分子作為模板分子，然后分別使用3D藥效團建模和子結構搜索篩選/生物等排替代方式對160萬小分子進行篩選構建而成。
  共價抑制劑庫	12K & DO2200	Chemdiv共價抑制劑庫旨在覆蓋用作共價反應基團的常見彈頭，另外從庫存的砌塊化合物中選取多樣的特有和獨特結構作為導引頭，設計合成各類共價抑制劑。共價抑制劑通用庫包含了各類常見的共價反應基團化合物。
  CNS MPO庫	30K & DP2250	使用gMPO對Chemdiv 160萬庫存化合物進行篩選評估，選取評分不低于4的化合物；然后利用藥化過濾器進行篩選，結構富集，最終得到此庫。
  3D生物活性多樣性庫	22K & D8800	該庫收集的小分子具有較好的核心骨架結構、三維空間結構和藥效團，展示出廣泛的生物學活性，它們潛在的靶標包括酶、膜受體、轉錄因子、表觀遺傳調節劑、離子通道、轉運蛋白和其他蛋白質，同時具有良好的ADMET性能。該庫包括蛋白質抑制劑/激活劑和受體激動劑/拮抗劑，活性化合物具有較低的分子量，較佳的LogP值和較佳的溶解度。
  已知活性化合物庫	22K & L4010	已知活性庫是 22555 個具有生物活性，能引起細胞、組織甚至個體生物學反應的化合物的集合。包括了正在進行臨床前研究的藥物分子，臨床期的藥物分子和已經上市的藥物。靶點明確，信息全面，非常適合完成藥物功能重定位、小分子誘導細胞分化以及機制研究中蛋白靶點確認等科研工作。
  天然產物庫	4533 & L6000	TargetMol天然產物庫精選了4533 種天然產物單體，這些天然產物單體來源豐富，結構多樣，具有很強的代表性。它們存在于三千余種中草藥植物、動物以及微生物中提取純化的天然來源中，涵蓋了五百余種不同骨架結構和千余種靶點受體，大部分成分都達到對照品純度。不僅如此，庫中還包含了眾多單價極高的稀有天然產物，性價比高。

  這些庫可在Targetmol（TargetMol Chemicals，第三方供應商）中找到， 我們可以與TargetMol合作使用它們。
• 參考文獻：
  [1] Coma, I. et al. Process validation and screen reproducibility in high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 14, 66–76 (2009).doi: 10.1177/1087057108326664
  [2] Pawe? Szymański, Magdalena Markowicz,* and El?bieta Mikiciuk-Olasik. Adaptation of High-Throughput Screening in Drug Discovery—Toxicological Screening Tests. Int J Mol Sci. 2012; 13(1): 427–452.Published online 2011 Dec 29. doi: 10.3390/ijms13010427

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