納米抗體制備

納米抗體服務簡介

• 納米抗體諸多方面均優于傳統抗體。基于駝科動物重鏈抗體的VHH單域抗體的特殊結構，兼具了傳統抗體與小分子藥物的優勢，幾乎完美克服了傳統抗體的開發周期長，穩定性較低，保存條件苛刻等缺陷，逐漸成為新一代治療性生物醫藥與臨床診斷試劑中的新興力量。
  相比于常規抗體，納米抗體的優勢有：
  分子量小，可穿透血腦屏障；原核或真核系統中高表達；特異性強，親和力高；對人的免疫原性弱等。

M13 噬菌體展示技術

• 噬菌體展示技術（phage display）是將外源編碼多肽或蛋白質的基因通過基因工程技術插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框能正確表達，使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，隨子代噬菌體的重新組裝呈現在噬菌體表面，可以保持相對的空間結構和生物活性。
  然后利用靶分子，采用合適的淘洗方法，洗去未特異性結合的噬菌體。再用酸堿或者競爭的分子洗脫下結合的噬菌體，中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴增，經過多輪的富集，逐步提高可以特異性識別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。

噬菌體文庫的構建與納米抗體的淘選

• 美迪西生物可以提供未經免疫的，足齡（24-36月齡）的駱駝進行抗原免疫，按照標準免疫方法，每個項目免疫4-6針，免疫期間為客戶提供ELISA效價測定服務，保證抗血清ELISA效價合格后采血分離PBMC。
  美迪西生物采用M13噬菌體的pIII蛋白進行VHH抗體(納米抗體)表面展示。我們的科學家構建了帶有HA和6*His tag雙標簽的噬菌粒載體，同時制備出了具有10⁸轉染效率的TG1宿主菌感受態，經過2-3次轉染與擴增，能夠為客戶提供有效庫容量大于10⁸的高質量VHH抗體展示文庫。經過幾輪納米抗體文庫淘篩，即可獲得至少20株具有高親和力的噬菌體株。

駱駝與羊駝VHH抗體文庫對比

• 比較項目	駱駝VHH抗體文庫	羊駝VHH抗體文庫
  抗原耐受量	高，可多種抗原混合高劑量免疫	較高，多種抗原混合中等免疫劑量
  HCAb血清中球蛋白比列	60%~80%	20%~30%
  中和抗體效價	高	較高
  采血量	一次可采血200ml	一次80-100ml血液
  有效庫容	高，免疫庫108-109	高，免疫庫107-108
  動物成本	較低	高
  抗原需求量	4-6mg，純度>85%	4-5mg，純度>85%

納米抗體制備服務流程示意圖

• 

  Image source: MA Lin-lin, et al. Construction and screening of phage display library for TIM-3 nanobody. Acta Pharmaceutica Sinica2018, 53 (3): 388-395.

駝科納米抗體文庫制備項目流程

• 步驟	內容	周期	交付
  第一步：抗原準備	客戶提供抗原或者美迪西準備抗原	3-4周	如果客戶提供抗原，質量標準：1. >5mg；2. SDS-PAGE >95%
  第二步：動物免疫	免疫未免疫的空白駱駝 5 ml 未免疫血清 ELISA檢驗血清效價	10-12周	如果由于抗原毒性導致的動物死亡,需要收取一定費用 根據 ELISA結果，客戶決定如何建庫
  第三步：抗體cDNA制備	外周血分離PBMC 提取總RNA并反轉錄為cDNA	3-4周	提供存放在Trizol 中的PBMC 提供高保真RT-PCR制備的cDNA
  第四步：噬菌體文庫構建	構建噬菌粒 噬菌體文庫構建		VHH片段插入率≥75% 有效庫容量≥108CFU/mL
  第五步：噬菌體文庫淘選	噬菌體展示納米抗體，淘選，至少淘選兩輪 陽性克隆的ELISA驗證、鑒定、篩選和測序（200個克隆測序） 陽性克隆測序及測序結果分析	4-6周	保證至少 20 個序列

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