細菌內(nèi)毒素檢測

細菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）實驗程序

• 1. 實驗準(zhǔn)備：試劑耗材及器具等
  美迪西使用的相關(guān)內(nèi)毒素檢測試劑耗材及器具都是經(jīng)過嚴格的供應(yīng)商篩選并采購，市面上公認的且符合要求的相關(guān)試劑和器具，如湛江安度斯品牌的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑和檢查用水等。
  
  2. 確定藥品的細菌內(nèi)毒素限值（L）
  產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素限值一般是通過公式L=K/M計算得到的。其中M為人用每千克體重每小時最大供試品劑量，可參考藥品說明書或具有權(quán)威性資料的用法用量。美迪西專業(yè)團隊也可提供相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)并結(jié)合預(yù)篩選試驗結(jié)果幫助客戶快速準(zhǔn)確制定相關(guān)限度標(biāo)準(zhǔn)。
  3. 計算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）
  4. 復(fù)核鱟試劑靈敏度
  5. 藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗
  6. 供試品干擾試驗以及干擾試驗的驗證
  凝膠法系利用細菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)可形成凝膠的原理，來測定供試品中的內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定。反應(yīng)過程中會受到很多因素的影響，經(jīng)常存在干擾問題。例如來自樣品中的主成分、輔劑、甚至一些雜質(zhì)等。大部分的干擾作用都可以通過使用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋供試品的方法排除。當(dāng)有些干擾作用僅使用稀釋法不能排除時，可采用其他方法消除干擾因素，然后再進行試驗。
  基于文獻和實踐經(jīng)驗案例等，美迪西整理出一套完善的各類干擾因素和對應(yīng)的排除方法，能夠?qū)崿F(xiàn)快速精準(zhǔn)排除干擾并進行驗證試驗。
  干擾因素和排除方法匯總表

  干擾因素	排除方法
  pH值的干擾	調(diào)節(jié)pH值至6.0~8.0
  二價陽離子濃度不足造成的干擾	添加適量Ca2+、Mg2+離子緩沖液
  內(nèi)毒素聚集造成的干擾	定期渦旋，配制前渦旋
  高濃度鹽或糖的干擾	稀釋或使用適當(dāng)超濾設(shè)備
  脂質(zhì)體的干擾	加內(nèi)毒素分散劑
  內(nèi)毒素吸附的干擾	首選硼硅酸鹽玻璃的稀釋管、反應(yīng)管、刻度吸管，一次性器具應(yīng)選擇聚苯乙烯
  表面活性劑的干擾	試驗用生理鹽水稀釋供試品，生理鹽水可使供試品鹽化，從而降低其表面活性
  酶、酶抑制劑帶來的干擾	將供試品適當(dāng)加熱使酶失活
  葡聚糖的干擾	使用抗增液復(fù)溶鱟試劑

  7. 供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。
  8. 可疑結(jié)果處理程序

  實驗人員首先對實驗項目進行回顧：檢驗用標(biāo)準(zhǔn)、檢驗操作、記錄和計算、儀器狀態(tài)、.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試劑質(zhì)量、其他異?，F(xiàn)象（是否有可能存在污染，環(huán)境、器械等）復(fù)核人員進行復(fù)核:若發(fā)現(xiàn)檢驗人員檢驗過程存在異常，復(fù)核人員以正確的檢驗過程重復(fù)實驗一次，以取代最初的實驗結(jié)果。若未發(fā)現(xiàn)檢驗人員檢驗過程存在異常，為了確定不合格結(jié)果是否由測試或分析誤差原因造成，復(fù)核人員可重復(fù)實驗。定量試驗提供數(shù)據(jù)參考不同鱟試劑的使用

案例

• 背景：脂質(zhì)體輔料工藝研發(fā)和生產(chǎn)項目，由于限度，客戶對于內(nèi)毒素檢測的方法始終沒有開發(fā)成功，如上所說，內(nèi)毒素檢測中因工藝引入或產(chǎn)品本身存在的一些干擾因素，在稀釋到產(chǎn)品最大有效稀釋倍數(shù)的情況下仍然不能排除干擾，抑制內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)導(dǎo)致供試品陽性對照組檢測為陰性。
  美迪西微生物團隊通過一整套相關(guān)干擾因素的排除，基于工藝步驟結(jié)合以往經(jīng)驗在短時間內(nèi)開發(fā)出能夠排除眾多干擾因素的產(chǎn)品前處理方法。
  1. 脂質(zhì)體水溶性差
  脂多糖的兩親性會使其對一些具有疏水基團的產(chǎn)品具有親和力，脂多糖與這些產(chǎn)品的結(jié)合會使其大小和形狀受到影響，以至于影響活性，使內(nèi)毒素試驗受到干擾，形成抑制。 通過加入適量內(nèi)毒素分散劑使產(chǎn)品中的內(nèi)毒素分離出來，可恢復(fù)內(nèi)毒素的活性。
  2. 螯合劑干擾
  工藝中引入的試劑含有螯合劑成分會螯合鱟試劑中的二價陽離子（如Mg²⁺離子）從而造成而家陽離子不足造成抑制。同時加入適量Mg²⁺離子緩沖液，排除工藝引入的相關(guān)螯合劑導(dǎo)致二價陽離子不足的干擾，從而使內(nèi)毒素正常激活鱟試劑的酶反應(yīng)。
  綜上排除多種因素干擾，在允許的最大稀釋倍數(shù)濃度下順利通過干擾實驗的驗證并完成限量檢查。幫助客戶在短周期內(nèi)實現(xiàn)快速交付。
• 注：
  參考安度斯相關(guān)資料
  中國藥典2020版四部通則1143 細菌內(nèi)毒素檢查法及
  中國藥典2020版四部通則9251 細菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則

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